乳酸和銨是細胞培養過(guò)程中不可避免的兩種代謝副產(chǎn)物，兩者的累積都是不想看到的，因為這兩種代謝副產(chǎn)物積累會(huì )影響到細胞生長(cháng)、蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量等。文中筆者對乳酸和銨影響細胞生長(cháng)的緣由，以及如何降低兩者的細胞**進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述。
乳酸
CHO細胞培養前期往往有少量的乳酸積累，特別是在細胞代謝旺盛的對數生長(cháng)期，一般情況下細胞都可以將這些乳酸代謝消耗掉。但有時(shí)這對于某些細胞株并不順利，乳酸的累積對細胞是致命的。乳酸主要來(lái)源于葡萄糖的不完全氧化，乳酸的累積會(huì )使體系pH降低，為使pH回升添加的堿液往往會(huì )增加體系的滲透壓，從而影響細胞正常生長(cháng)代謝。而如果不加堿液調節pH，低pH環(huán)境對于細胞體內的酶不是個(gè)好消息，酶活的降低會(huì )限制細胞代謝，影響細胞生長(cháng)。
為解除乳酸對細胞生長(cháng)及蛋白產(chǎn)量的影響，可以考慮構建對環(huán)境壓力耐受性高的細胞株，也可對細胞培養策略進(jìn)行優(yōu)化。用代謝緩慢的糖類(lèi)代替葡萄糖作為碳源可以降低乳酸的累積，如半乳糖、巖藻糖和麥芽糖的使用。而當乳酸有一定累積時(shí)，可以通過(guò)葡萄糖的濃度來(lái)改變細胞的代謝路徑，改葡萄糖代謝為乳酸代謝，從而減少乳酸累積，但低糖消耗乳酸的策略對蛋白質(zhì)量的影響并不明確。對細胞進(jìn)行基因改造也可以降低乳酸累積，如刪除乳酸脫氫酶（LDH）基因、擴增丙酮酸羧化酶（PYC2）基因等。其中LDH是催化丙酮酸生成乳酸重要的酶，PYC2是參與將乳酸、丙酮酸、氨基酸及甘油轉化生成葡萄糖的催化酶，對兩者的基因改造可在代謝通路減少乳酸累積。
上述的方法雖然可降低乳酸累積，但操作性不強。筆者認為，銅離子（Gu2+）的添加是目前為止降低乳酸累積的方法，除去Gu2+抑制乳酸累積的作用，許多研究中都提到Gu2+對細胞的生長(cháng)具有促進(jìn)作用。Luo等就研究了不同濃度的Gu2+對細胞生長(cháng)、乳酸累積和蛋白產(chǎn)量的影響，如圖1所示，培養至第五天時(shí)，細胞表現開(kāi)始出現差異，高濃度Gu2+實(shí)驗組細胞密度繼續增加、乳酸開(kāi)始消耗；而低濃度Gu2+實(shí)驗組的乳酸一直在累積，開(kāi)始顯現出對細胞的抑制作用；從蛋白產(chǎn)量看，高濃度Gu2+實(shí)驗組的蛋白濃度要高些，可知Gu2+的添加可促進(jìn)細胞對乳酸的消耗及細胞生長(cháng)。值得注意的是，Gu2+的添加會(huì )影響到單抗的質(zhì)量，如增加堿性峰的比例、降低高甘露糖型水平等。
圖1 Gu2+濃度對細胞生長(cháng)、乳酸累積及蛋白產(chǎn)量的影響
（圖片來(lái)源于參考文獻1）
銨
作為細胞培養過(guò)程中的另一代謝副產(chǎn)物，銨受到的關(guān)注遠沒(méi)有乳酸多，這是因為目前使用的CHO細胞中多采用的谷氨酰胺合成酶（GS）擴增系統，而GS細胞一般都可以利用銨來(lái)合成谷氨酰胺，因此關(guān)于降低銨累積對細胞**作用的研究較少。然而并不是所有的細胞系都是GS系統，還有二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，DHFR）篩選系統等，因此對銨的**機理、降低累積的認識還是很有必要的，可以幫助我們更好的理解細胞培養過(guò)程。
體系中的銨主要來(lái)自于谷氨酰胺等的代謝降解和自發(fā)降解，其中自發(fā)降解只占很少一部分，大部分的銨都來(lái)自氨基酸如谷氨酰胺的代謝降解。正常情況下，培養體系中、細胞質(zhì)內和線(xiàn)粒體的內銨（NH4+）和氨（NH3）是處于一種動(dòng)態(tài)平衡下的，一定的pH時(shí)兩者維持一定的濃度，同樣兩者的平衡也是維持細胞胞內pH穩定的重要條件。而當其中之一，如NH4+的濃度超出正常范圍時(shí)，平衡被打破，進(jìn)而引起胞內pH的變化，影響細胞代謝相關(guān)酶的活性，不利于細胞的正常生長(cháng)與代謝。還有學(xué)者認為，由于銨本身就參與部分酶促反應，如谷氨酸和銨合成谷氨酰胺的反應、谷氨酸的進(jìn)一步降解等，銨濃度的改變也會(huì )對此類(lèi)代謝產(chǎn)生不可預估的影響。
由此可知，銨的累積會(huì )導致胞內pH失衡及酶活降低，進(jìn)而影響細胞表現。此外，銨的累積還會(huì )對蛋白質(zhì)量造成影響，主要表現在降低糖鏈末端的唾液酸化水平。高濃度銨水平下，α(2,3)-唾液酸轉移酶和GMP-唾液酸轉運蛋白水平都有一定降低，這不僅會(huì )導致胞液中唾液酸向高爾基體的轉動(dòng)量降低，還會(huì )影響糖鏈上的唾液酸連接，最終降低蛋白的唾液酸化。
根據銨的來(lái)源來(lái)降低是重要的策略，如采用不易自發(fā)降解的谷氨酰胺衍生物代替谷氨酰胺，以及使用谷氨酸代替谷氨酰胺添加到培養基中都是可以的方法。還有學(xué)者以氨基酸為出發(fā)點(diǎn)，研究了不同氨基酸對降低銨對細胞**的影響，最終得出蘇氨酸（threonine）、脯氨酸（proline）和甘氨酸（glycine）可以抑制高濃度銨對細胞的**。如圖2所示，同樣高濃度NH4Cl的情況下，添加以上三種氨基酸實(shí)驗組的細胞要高些?；蚴侄我部梢越档弯@的累積，例如刪除乳酸脫氫酶（LDH）基因，有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗時(shí)發(fā)現LDH基因刪除的實(shí)驗組，其乳酸及銨累積均有一定的降低。另外，合理的谷氨酰胺和葡萄糖補料策略也是控制銨濃度的方法之一。
圖2 氨基酸對高濃度銨離子添加培養基中細胞密度的影響
（圖片來(lái)源于參考文獻2）
參考文獻：
1. Comparative Metabolite Analysis to Understand Lactate Metabolism Shift in Chinese Hamster Ovary Cell Culture Process；
2. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells。
作者簡(jiǎn)介：知行，生物化工碩士，從事細胞培養方面的研究。工作之余密切關(guān)注國內外醫藥行業(yè)動(dòng)態(tài)以及研究進(jìn)展，用簡(jiǎn)單的語(yǔ)言講述不簡(jiǎn)單的未來(lái)，一個(gè)不斷前行的醫藥人。
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