早在2012年8月，Doudna教授與現任Max Planck研究所感染生物學(xué)部主任的Emmanuelle Charpentier在Science雜志上發(fā)表了一篇題為“A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity”的重要成果，首次揭示了CRISPR/Cas這一天然免疫系統的基因組編輯功能。
In the genome editing technology known as CRISPR-Cas9, RNA (blue) guides the protein Cas9 (large bumpy structure) to a target site in DNA (red). Cas9 unwinds the DNA double helix and acts as molecular scissors, snipping both strands of DNA.
之后，以CRISPR-Cas9為代表的新型基因編輯技術(shù)迅速風(fēng)靡科研圈，革新了生物醫學(xué)研究，加速了疾病成因的探索，并引發(fā)了許多潛在的新療法。與此同時(shí)，CRISPR家族也不斷擴大，很多“新成員”浮出水面，其中就包括了CRISPR-Cas12a。
關(guān)鍵酶——Cas12a
與大家熟知的Cas9酶類(lèi)似，Cas12a可用于切割目標DNA。該蛋白最初被稱(chēng)為Cpf1，于2015年由張鋒團隊在一篇題為“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”的Cell論文中首次提出。
學(xué)界認為，Cas12a是基因切割工具箱的一個(gè)重要補充，能夠在Cas9不能作用的位置切割雙鏈DNA；同時(shí)，由于Cas12a切割DNA后留下的是不規則的邊緣（ragged edges），這可能使在切割處插入一個(gè)新的基因更容易。
不過(guò)，Doudna教授的團隊發(fā)現，當Cas12a結合并切割了目標雙鏈DNA時(shí)，它會(huì )在試管中出人意料地對所有的單鏈DNA發(fā)動(dòng)任意切割。
值得慶幸的是，由于細胞中大部分DNA是以雙鏈螺旋的形式存在，因此，這一發(fā)現對于Cas12a的基因編輯功能并不一定是個(gè)問(wèn)題。相反，Cas12a對單鏈DNA的這種“任意切割”還給科學(xué)家們帶來(lái)了驚喜：允許他們將一個(gè)單鏈“報告”分子與Cas12a蛋白進(jìn)行聯(lián)用，當Cas12a發(fā)現它的目標后，報告分子會(huì )產(chǎn)生一種清晰的熒光信號。
圖片來(lái)源：Science（DOI: 10.1126/science.aar6245）
快速、簡(jiǎn)便的診斷系統——DETECTR
基于這一思路，Doudna教授團隊開(kāi)發(fā)出一種被稱(chēng)為“DETECTR”（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）的診斷系統，可用于對臨床樣本中的少量DNA進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便地即時(shí)檢測。相關(guān)成果以“CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity”為題發(fā)表在Science雜志上。
Infographic by the Howard Hughes Medical Institute
具體來(lái)說(shuō)，DETECTR是在一個(gè)單一反應中添加所有試劑，包括CRISPR-Cas12a和它的向導RNA、熒光報告分子以及一種叫做RPA（recombinase polymerase amplification，類(lèi)似于PCR）的等溫擴增系統。當加熱到體溫時(shí)，RPA會(huì )快速增加目標DNA的拷貝數，使Cas12a更容易找到并切割它，然后任意切割附近單鏈DNA，從而讓報告分子發(fā)出熒光（具體發(fā)光機制見(jiàn)上圖）。
基于CRISPR-Cas12a的DETECTR系統能夠分析細胞、血液、唾液、尿液和糞便，以檢測基因突變、癌癥和抗生素耐藥性，以及診斷細菌和病毒感染。
研究中，科學(xué)家們利用包含人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的患者樣本對DETECTR進(jìn)行了測試。結果顯示，利用DETECTR，他們能夠在感染多種不同HPV類(lèi)型的樣本中準確測定出高風(fēng)險的HPV 類(lèi)型：HPV16和HPV18。
論文的共同第一作者Janice S. Chen認為，Cas12a可作為一種強有力的工具，用于從各種各樣的來(lái)源中檢測DNA。DETECTR這項技術(shù)可能適用于任何基于DNA檢測的即時(shí)診斷情況，包括癌癥和傳染病。
再次驗證CRISPR酶的檢測功能
事實(shí)上，Cas12a與CRISPR酶家族的另一個(gè)蛋白Cas13a活性類(lèi)似。也正是利用后者，張鋒團隊在同日發(fā)表在Science論文中提出了升級版的診斷工具SHERLOCK。詳細閱讀《張鋒最新Science！CRISPR新功能升級，可用于腫瘤DNA等多種核酸檢測》一文。
Cas13a于2016年6月由張鋒團隊首次發(fā)現；3個(gè)月后，女神研究組就證實(shí)了該酶的“collateral cleavage”活性（Cas13a在切割了它的意向RNA目標后依然能夠保持“活躍”，繼續爆發(fā)性式地切割其他非目標RNA）可用于RNA檢測。不多久（2017年4月），張鋒團隊也開(kāi)發(fā)出了基于Cas13a的初級版SHERLOCK。兩大陣營(yíng)在這一研究方向的競爭可謂非常激烈。
Doudna教授說(shuō)：“現在，我們仍著(zhù)迷于細菌CRISPR系統的功能，以及如何借助對相關(guān)機制的理解來(lái)產(chǎn)生新的技術(shù)。”
此次，雙方于同日在Science發(fā)表新成果，不管是雜志刻意安排，還是一種巧合，都再次證實(shí)了CRISPR酶用于核酸檢測的實(shí)力?；蛟S，除了基因編輯，CRISPR還能帶給我們帶來(lái)更多、更大的驚喜！
參考資料：
CRISPR scissors, Cas12a, enables cutting-edge diagnostics
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