TCR 與 CAR療法比較

       TCR和CAR療法都對患者自身的T淋巴細胞在體外進(jìn)行改造，然后將它們注回患者體內殺傷腫瘤的癌癥療法，但是它們識別抗原的機制截然不同。TCRs利用α和β肽鏈構成的異元二聚體（heterodimer）來(lái)識別由主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）呈現在細胞表面的多肽片段。而CARs則利用能夠與特定抗原結合的抗體片段來(lái)識別腫瘤細胞表面的抗原。因為MHC分子能夠呈現從細胞表面和細胞內蛋白中獲得的肽鏈，TCRs與CARs相比，能夠靶向更多種抗原。

       ▲因為MHC分子能夠呈現從細胞表面和細胞內蛋白中獲得的肽鏈，TCRs與CARs相比，能夠靶向更多種抗原。（圖片來(lái)源：《Nature Biotechnology》）

       理論上講，在治療實(shí)體瘤方面TCRs與CARs相比有著(zhù)明顯的優(yōu)勢。“CAR-T細胞治療實(shí)體瘤方面的問(wèn)題是因為它們的靶點(diǎn)抗原都是細胞表面蛋白，”Adaptimmune公司的聯(lián)合創(chuàng )始人Bent Jakobsen博士說(shuō)。“我不知道是不是存在對人類(lèi)癌癥具有特異性的細胞表面蛋白，”約翰?霍普金斯大學(xué)（Johns Hopkins University）的免疫學(xué)家Jonathan Schneck博士說(shuō)：“即便CAR-T細胞殺傷腫瘤細胞的功能卓越，如果沒(méi)有合適的靶點(diǎn)我們也無(wú)法對實(shí)體瘤產(chǎn)生真正的影響。”

       而TCRs靶向的細胞內蛋白具備腫瘤特異性。這些抗原包括由于腫瘤DNA的隨機突變造成的新抗原（neoantigen）和所謂的癌睪丸抗原（cancer testis antigens）。這些抗原通常只在某些腫瘤和生殖系組織（germline tissue）中表達，而生殖系組織不會(huì )表達MHC。

       而且，表達TCR的T細胞通常侵入腫瘤內部的能力會(huì )強于CARs，而CARs通常會(huì )附著(zhù)在腫瘤的外層而不向內部滲透。這是因為CAR靶向的抗原可能在腫瘤表面有上千個(gè)拷貝，它們會(huì )在CARs滲透到腫瘤內部之前就將它們都吸收了。而TCRs在最初碰到腫瘤時(shí)遇到的抗原可能少于50個(gè)拷貝，這讓CARs能夠進(jìn)一步深入腫瘤內部與抗原結合，從而保證更均衡的藥物分布。

       TCR療法的起步和挑戰

       TCR療法的概念其實(shí)早于CARs產(chǎn)生。1986年，在巴塞爾免疫研究所（Basel Institute for Immunology）工作的Michael Steinmetz博士第一次將一個(gè)T細胞的TCR基因轉移到另一個(gè)T細胞中，從而賦予第二個(gè)T細胞相同的抗原特異性。這是當今TCR基因療法的祖先。上世紀末，在美國國家癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）的Steve Rosenberg博士和Phil Greenberg博士率領(lǐng)的研究團隊證明可以通過(guò)分離特定TCR賦予T細胞新的抗原特異性。2004年，Rosenberg博士的團隊啟動(dòng)了第一個(gè)TCR基因療法的臨床試驗，接受治療的15名黑色素瘤患者中有兩位的腫瘤達到完全緩解。這些患者自身的T細胞在體外得到擴增，并且在細胞中表達了對MART-1抗原具有特異性的TCRs。

       ▲Steve Rosenberg博士（圖片來(lái)源：By Rhoda Baer (Photographer) [Public domain], via Wikimedia Commons）

       同時(shí)，克隆TCRs并且將它們整合到病毒載體中使它們在T細胞中有效表達的技術(shù)日漸完善。2008年以來(lái)，多個(gè)TCR生物技術(shù)公司開(kāi)始出現。其中Adaptimmune公司在2008年脫離MediGene成為獨立公司，Kite Pharma在2009年成立并且隨后與NCI達成研究協(xié)議。Juno Therapeutics在2013年于西雅圖成立。Kite（如今是Gilead的子公司）和Juno（如今被Celgene收購）在開(kāi)發(fā)TCR療法的同時(shí)也在開(kāi)發(fā)CAR療法。目前至少有16個(gè)臨床試驗正在驗證TCR療法在治療實(shí)體瘤方面的療效。

       ▲目前至少有16個(gè)臨床試驗正在驗證TCR療法在治療實(shí)體瘤方面的療效。（圖片來(lái)源：《Nature Biotechnology》）

       但是在TCR療法的開(kāi)發(fā)過(guò)程中也遭受過(guò)嚴重的挫折。2011年，在NCI進(jìn)行的利用靶向癌睪丸抗原MAGE-A3的TCRs治療實(shí)體瘤的臨床試驗中，頭9位患者中有3位患者在接受治療后立即出現嚴重**狀態(tài)變化，其中兩位很快昏迷并且去世。與此同時(shí)，賓夕法尼亞大學(xué)（University of Pennsylvania）的Carl June教授的團隊也在使用Adaptimmune公司開(kāi)發(fā)的靶向MAGE-A3的TCRs。頭兩位接受TCR療法的患者迅速出現心源性休克（cardiogenic shock），在一周內去世。

       ▲Carl June教授（圖片來(lái)源：University of Pennsylvania官方網(wǎng)站）

       后續研究表明NCI 的MAGE-A3 TCR意外地能夠與在大腦中的相關(guān)多肽MAGE-A12相結合。而Adaptimmune公司的TCR能夠與心臟中的肌聯(lián)蛋白（titin）相結合。肌聯(lián)蛋白被MHC呈現的多肽與MAGE-A3非常相似。

       為了防止類(lèi)似事件的發(fā)生，Adaptimmune公司完全更新了篩查T(mén)CR特異性的系統，讓研究人員能夠確定在整個(gè)多肽組（peptidome）中TCR能夠與那些多肽結合。這會(huì )大幅度提高TCR的安全性。雖然安全性一直是人們關(guān)心的問(wèn)題，但是在最近的臨床試驗中檢驗的TCR療法都表現出可以接受的安全性。

       權衡利弊

       目前對TCR療法來(lái)說(shuō)最關(guān)鍵的問(wèn)題是選擇哪種與腫瘤相關(guān)的抗原作為靶點(diǎn)。它們可以被分為3大類(lèi)：過(guò)度表達的自身抗原，癌睪丸抗原，和新抗原。每一種類(lèi)別都有自己的優(yōu)劣，而Juno, Adaptimmune和Kite三家公司也選擇了不同的開(kāi)發(fā)方向。

       Juno公司選擇的是過(guò)度表達的自身抗原。該公司將使用靶向WT1的TCR治療急性淋巴細胞白血?。╝cute myeloid leukemia），間皮瘤（mesothelioma）和肺癌，利用靶向間皮素（mesothelin）的TCR治療胰 腺癌的臨床試驗將在今年開(kāi)始。WT1和間皮素雖然在有些正常組織中表達，但是在很多腫瘤中高度表達。在某些情況下，TCRs可以在攻擊腫瘤細胞的同時(shí)對正常細胞沒(méi)有反應。因為有研究表明可以選擇或者改進(jìn)TCRs，讓它們只識別在腫瘤表面高水平表達的抗原。表達這類(lèi)TCRs的T細胞應該可以安全地殺死腫瘤細胞。這一策略如果成功，意味著(zhù)可能有上千種腫瘤過(guò)度表達的蛋白成為靶點(diǎn)。

       但是靶向這類(lèi)抗原同時(shí)也存在著(zhù)風(fēng)險，例如，WT1在包括心臟在內的幾種關(guān)鍵組織中表達。間皮素在有些組織的間皮細胞中也有低水平的表達，其中包括氣管。所以這些療法有可能帶來(lái)對健康組織的**。

       因為這個(gè)原因，Adaptimmune公司基本上避免靶向過(guò)度表達的自身抗原。該公司選擇的是癌睪丸抗原，最初的靶點(diǎn)包括MAGE-A10、MAGE-A4、PRAME和NY-ESO-1。這些抗原的特點(diǎn)是它們在成人組織中幾乎不會(huì )被處理成為多肽鏈。癌睪丸抗原的劣勢一直是表達這些抗原的癌癥種類(lèi)較少。因此在癌癥患者中篩選出適合這一療法的患者是一個(gè)非常昂貴和費時(shí)的過(guò)程。但是在特定的幾種腫瘤患者中，MAGE-A4和PRAME抗原的表達比例很高，因此在這些腫瘤種類(lèi)中篩選患者是可行的。

       例如NY-ESO-1在滑膜肉瘤（synovial sarcoma）中出現的幾率高達70%，因此Adaptimmune公司募集這些患者進(jìn)行了一項臨床1/2期試驗。在去年六月舉行的ASCO年會(huì )上該公司公布了其中一個(gè)患者群的試驗結果：60%的患者對TCR療法產(chǎn)生反應，其中一名患者達到完全緩解。預計平均總存活期可以達到159周。

       新抗原：個(gè)體化醫療的可行性

       在Juno公司通過(guò)謹慎靶向自身抗原來(lái)治療常見(jiàn)癌癥，而Adaptimmune的TCR策略將療法安全性放在首位的同時(shí)，NCI的Rosenberg博士和他的團隊以及他們在Kite Pharma的合作伙伴嘗試在保證安全性的同時(shí)，提高可治療患者的數量。他們選擇的是個(gè)體化TCR療法的方向。為了達到這一目標，他們靶向的是腫瘤中出現的新抗原，這些抗原由于腫瘤細胞的DNA突變產(chǎn)生。它的優(yōu)點(diǎn)是幾乎所有癌癥患者都會(huì )產(chǎn)生新抗原，而且這些新抗原都具備腫瘤特異性。“壞消息是由于每個(gè)患者產(chǎn)生的新抗原都不同，這意味著(zhù)療法需要對每個(gè)患者進(jìn)行個(gè)體化的優(yōu)化，生產(chǎn)工序將變得非常復雜。”Rosenberg博士說(shuō)。

       使用新抗原作為T(mén)CR的靶點(diǎn)首先需要發(fā)現這些新抗原，腫瘤細胞DNA上發(fā)生的突變只有少量能夠導致新抗原的產(chǎn)生，目前沒(méi)有很好的算法能夠從DNA序列的變化預測新抗原的產(chǎn)生。Rosenberg博士的團隊將攜帶患者腫瘤基因突變的DNA序列表達在樹(shù)突狀細胞中，然后檢測哪些序列能夠產(chǎn)生被MHC呈現的含有突變的多肽鏈。同時(shí)檢測從患者身上收集的T淋巴細胞能否對呈現的多肽鏈產(chǎn)生反應。如果患者的淋巴細胞能夠產(chǎn)生反應，這意味著(zhù)一個(gè)新抗原被發(fā)現了。研究人員可以收集患者的T淋巴細胞并且富集對新抗原有反應的淋巴細胞作為療法。

       利用這種方法，Rosenberg博士的團隊成功在一名膽管癌（cholangiocarcinoma）復發(fā)的患者身上發(fā)現一種新抗原，將針對這種新抗原的T淋巴細胞進(jìn)行富集并且注入患者體內導致患者在肺部和肝 臟的轉移瘤縮小并且反應時(shí)間長(cháng)達2.5年。他的研究團隊已經(jīng)在結腸癌、乳腺癌、膽管癌和宮頸癌患者身上獲得過(guò)成功。Rosenberg博士的團隊目前使用的是利用對新抗原反應性進(jìn)行富集的T淋巴細胞，可以預見(jiàn)的是下一步研究人員將嘗試針對新抗原的TCRs。TCRs的優(yōu)勢是它們可以通過(guò)人工設計產(chǎn)生非常高的親和力。

       但是這種個(gè)體化的TCR療法工序能否推廣和擴大化是一個(gè)有爭議的話(huà)題。使用目前的制造工藝，整個(gè)產(chǎn)生個(gè)體化TCR療法的過(guò)程要花費大半年的時(shí)間，在這期間患者的癌癥將繼續惡化。目前限制這一療法的兩大阻礙是TCR克隆和病毒載體的構建和驗證。TCR克隆過(guò)程通常需要6~8周才能完成，而在良好生產(chǎn)規范（good manufacturing practice, GMP）狀態(tài)下構建病毒載體并且對它進(jìn)行安全性檢測需要花費6個(gè)月的時(shí)間和大約25萬(wàn)美元。“目前這種方法無(wú)法進(jìn)行擴大化生產(chǎn)，”Greenberg博士說(shuō)：“成本實(shí)在太高了。”而且通常一個(gè)基因突變不會(huì )在所有腫瘤細胞中存在，于是你要對多個(gè)新抗原做同樣的事。腫瘤異質(zhì)性對所有TCR療法都是一個(gè)挑戰，但是靶向單個(gè)新抗原可能是一種事倍功半的做法。

       Rosenberg博士的團隊在使用機器人系統力圖用最少的細胞篩選更多基因突變，從而加快TCR的克隆過(guò)程。在構建載體方面，病毒載體可能被睡美人轉座子（sleeping beauty transposon）系統或CRISPR-Cas9基因編輯系統取代。位于波士頓的Ziopharm公司的轉座子系統已經(jīng)被證明可以將靶向新抗原的TCR成功轉移到T細胞中。這一系統已經(jīng)在幾項臨床試驗中使用。轉座子載體的構建和擴增都在質(zhì)粒DNA中完成，這將大幅度減少與病毒載體相關(guān)的花費和監管負擔。

       雖然研究人員承認靶向新抗原的個(gè)體化TCR療法目前還不完善。“它還是太慢了，太貴了，”Rosenberg博士的長(cháng)期合作者Nick Restifo博士說(shuō)：“但是它正在變得更快和更便宜。”更多的生物公司也加大對這一領(lǐng)域的投入。位于麻省劍橋的Neon Therapeutics公司最近與瑞士巴塞爾（Basel）的CRISPR Therapeutics公司達成合作，共同開(kāi)發(fā)基于新抗原的T細胞療法。“我從來(lái)沒(méi)有想過(guò)基于新抗原的TCR療法能夠獲得商業(yè)成功，”June博士說(shuō)：“但是它將會(huì )發(fā)生。”

       打破腫瘤耐受的方法

       擁有迅速并且廉價(jià)的靶向新抗原的TCR系統本身并不足以治愈大多數轉移性癌癥。因為這些腫瘤通常會(huì )制造一個(gè)免疫耐受的環(huán)境，讓針對腫瘤的T細胞無(wú)法被正常激活。“最終我們需要的不單是靶向單個(gè)新抗原，而是同時(shí)帶來(lái)更廣泛的免疫反應，”Jakobsen博士說(shuō)：“這樣你才能打破對腫瘤的免疫耐受狀態(tài)。這是讓免疫系統重新獲得控制權的方法。”

       目前的免疫療法很少能夠達到這一目標?，F有的TCR療法在縮小腫瘤和啟動(dòng)免疫反應方面能夠起到一些作用，但是關(guān)鍵是找到某些能夠激發(fā)對腫瘤的多克隆免疫反應的方法。將TCRs與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合使用可以達到這一目標，但是如PD-1阻斷劑一類(lèi)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑在攜帶高基因突變負擔的腫瘤中效果，在結直腸癌、乳腺癌、胰 腺癌和前列腺癌中卻很少能夠起作用。

       其它方法包括在TCRs中引入共受體（co-receptor）。“基本上所有在CARs中做過(guò)的改進(jìn)方法你都可以想像在TCRs中進(jìn)行，”伊利諾伊大學(xué)（University of Illinois）的免疫學(xué)家David Kranz博士說(shuō)。另外一種方法是將TCR細胞療法與激活干擾素基因的激動(dòng)劑一起使用。

       而最明顯的激活多克隆腫瘤免疫反應的方法是通過(guò)CD4 輔助性T細胞（helper T cells）。CD4細胞能夠增強抗原呈現并且通過(guò)多種機制加強CD8效應T細胞的功能。比如CD4細胞可以分泌干擾素γ，它能夠導致一類(lèi)和二類(lèi)MHC分子的表達并且在樹(shù)突狀細胞中提高抗原呈現機制中其它成份的表達。Kranz博士認為在CD4細胞中使用TCR將是下一個(gè)重要研究方向。

       “這是產(chǎn)生更多CD8和CD4細胞，讓它們識別除了你靶向的抗原以外的其它抗原的刺激方法，”Jakobsen博士說(shuō)。癌癥免疫學(xué)家認為這種抗原表位擴展（epitope spreading）的效應是消滅實(shí)體瘤的關(guān)鍵。

       CARs 和 TCRs 的未來(lái)

       一種能夠同時(shí)幫助CARs和TCRs療法的技術(shù)是Cell Design Labs公司的合成Notch受體（Synthetic Notch Receptor，SynNotch）技術(shù)。這種技術(shù)能夠在細胞中建立一個(gè)能夠感知組織特異性的SynNotch。它相當于一個(gè)開(kāi)關(guān)，讓表達在T細胞表面的TCRs或CARs只有在特定組織中才會(huì )被激活。SynNotch能夠幫助CARs克服在治療實(shí)體瘤方面的挑戰，那就是沒(méi)有足夠特異性的腫瘤抗原。

       June教授認為CAR和TCR療法最終都將對實(shí)體瘤產(chǎn)生作用。而且CARs和TCRs應該合并成為組合療法，因為腫瘤對這兩種療法產(chǎn)生抗性的方法截然不同。腫瘤通過(guò)丟失MHC來(lái)逃避TCRs，而對CAR-T細胞的逃逸是通過(guò)丟失靶向抗原來(lái)完成。腫瘤細胞不太可能同時(shí)產(chǎn)生兩種抗性，因此CAR-TCR組合療法能夠消滅它們。“因為人類(lèi)實(shí)體瘤的克隆復雜性，我認為只用一種細胞，一個(gè)CAR或者一個(gè)TCR就能成功是不現實(shí)的，”June博士說(shuō)：“一旦你認可了使用細胞療法來(lái)治療患者，那么生產(chǎn)一個(gè)同時(shí)包括CAR和TCR的產(chǎn)品的成本并不會(huì )增加多少。”

       去年9月，葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）公司斥資6100萬(wàn)美元從Adaptimmune公司買(mǎi)入了一個(gè)TCR基因療法項目。這個(gè)信號表明大量涌入CARs的投資也惠及TCRs。不過(guò)在TCRs領(lǐng)域的一個(gè)明確的臨床成功將對這一領(lǐng)域的投入產(chǎn)生很大幫助。“現在很多公司都在等待看到概念驗證上的成功才會(huì )跟進(jìn)，”Greenberg博士說(shuō)。不過(guò)那些在TCR領(lǐng)域孤獨地工作了數十年的核心科學(xué)家們終于很高興地看到，這項技術(shù)成為治療癌癥的主流之一并且在經(jīng)歷爆炸性的發(fā)展。

       參考資料：

       [1] Driving T-cell immunotherapy to solid tumors

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