自2016年David Liu實(shí)驗室、日本神戶(hù)大學(xué)Akihiko Kondo實(shí)驗室以及我國科學(xué)家常興實(shí)驗室先后在Nature、Science和Nature Methods雜志上發(fā)表了基于Cas9的單堿基基因編輯系統之后，相關(guān)研究迅猛發(fā)展、方興未艾。由于單堿基編輯系統可能極大地推動(dòng)疾病模型制備、動(dòng)植物的育種和人類(lèi)疾病的臨床治療，因此目前迫切需求該系統變得越來(lái)越精確高效。目前已報道的堿基編輯系統均是基于Cas9蛋白，然而基于Cpf1（Cas12a）的新型堿基編輯器暫未見(jiàn)報道。那么基于Cpf1（Cas12a）的單堿基編輯系統有什么優(yōu)勢呢？

       近日，上?？萍即髮W(xué)生命學(xué)院陳佳教授研究組、中國科學(xué)院－馬普計算生物學(xué)研究所研究員楊力研究組與上?？萍即髮W(xué)生命學(xué)院黃行許教授研究組通過(guò)合作研究，開(kāi)發(fā)出一系列基于CRISPR/Cpf1（Cas12a）的新型堿基編輯器（Cpf1-BE），相關(guān)成果以Base editing with a Cpf1– cytidine deaminase fusion為題，在Nature Biotechnology 上在線(xiàn)發(fā)表。

       傳統的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)雖然具有較高的基因敲除效率，但在執行堿基替換（譬如對造成遺傳性疾病的點(diǎn)突變進(jìn)行矯正）時(shí)效率通常很低，這也限制了CRISPR/Cas9基因編輯的應用。近年，利用將CRISPR/Cas9和APOBEC（胞嘧啶脫氨酶）整合而發(fā)展出的新型堿基編輯系統（Base Editor, BE），可在單堿基水平（如胞嘧啶向胸腺嘧啶）實(shí)現高效率的基因組靶向編輯改造【1-7】。這種新型堿基編輯系統理論上可對數百種引起人類(lèi)疾病的基因組點(diǎn)突變進(jìn)行定點(diǎn)矯正，因此擁有巨大的臨床應用潛力。

       目前已報道的堿基編輯系統均是利用Cas9蛋白（主要是Streptococcus pyogenes Cas9, SpCas9和Staphylococcus aureus Cas9, SaCas9）執行與基因組的靶向性結合，而這種靶向性結合依賴(lài)于靶點(diǎn)旁側的PAM（Protospacer Adjacent Motif）序列。SpCas9和SaCas9蛋白所識別的PAM序列多含鳥(niǎo)嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已報導的堿基編輯系統無(wú)法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）區域進(jìn)行高效的堿基編輯操作。

       在這項最新的研究中，來(lái)自上?？萍即髮W(xué)和中科院的科研人員通力合作，構建了一系列基于CRISPR/Cpf1蛋白的新型堿基編輯器（Cpf1-BE）。由于Cpf1 蛋白可識別富含腺嘌呤/胸腺嘧啶的PAM序列【8-12】，這種基于Cpf1的新型堿基編輯器實(shí)現了在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集區域的堿基編輯操作。在拓展編輯區域的同時(shí)，基于Cpf1的新型堿基編輯器所產(chǎn)生的編輯副產(chǎn)物也較低，因此具有更高的編輯精準度。這種基于Cpf1的新型堿基編輯器與現有的基于Cas9的堿基編輯器可實(shí)現堿基編輯的有效互補，為堿基編輯系統在基礎研究及未來(lái)臨床領(lǐng)域的全面深入應用提供了新方法、拓展了新思路。

       Cas9堿基編輯器與Cpf1堿基編輯器的特點(diǎn)比較

       據悉，該工作在陳佳教授、楊力研究員、黃行許教授的共同指導下，由陳佳研究組2014級碩博連讀研究生李瀟颯、楊力研究組2015級碩博連讀研究生王瀅和黃行許研究組2014級碩博連讀研究生劉亞京等共同完成。

       值得一提的是，陳佳課題組和楊力課題組及其合作者在最近一年時(shí)間中先后還在Cell Research和Nature Structure Molecular Boilogy雜志上發(fā)表研究論文，開(kāi)發(fā)了一種增強型堿基編輯器（enhanced base editor, eBE），其克服了原有堿基編輯技術(shù)保真度較低的缺陷，實(shí)現了更高準確度的基因組單堿基編輯【6】；研究揭示了胞嘧啶脫氨酶(APOBEC)在CRISPR/Cas9引發(fā)的DNA斷裂修復過(guò)程中產(chǎn)生突變的新機制，提出了利用雙鏈寡聚核苷酸或者雙鏈質(zhì)粒DNA作為修復模版、以及抑制內源APOBEC的策略來(lái)提高CRISPR/Cas9編輯的保真度和精確性，為進(jìn)一步提高基因組編輯保真度提供了新思路【13】。

       參考資料

       1. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA and Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533:420-424

       2. Nishida K, Arazoe T, Yachie N, Banno S, Kakimoto M, Tabata M, Mochizuki M, Miyabe A, Araki M, Hara KY, Shimatani Z and Kondo A. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016, 353:

       3. Kim K, Ryu SM, Kim ST, Baek G, Kim D, Lim K, Chung E, Kim S and Kim JS. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nat Biotechnol, 2017

       4. Zong Y, Wang Y, Li C, Zhang R, Chen K, Ran Y, Qiu JL, Wang D and Gao C. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9- cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017

       5. Lu Y and Zhu JK. Precise Editing of a Target Base in the Rice Genome Using a Modified CRISPR/Cas9 System. Mol Plant, 2017, 10:523-525

       6. Wang L, Xue W, Yan L, Li X, Wei J, Chen M, Wu J, Yang B, Yang L and Chen J. Enhanced base editing by co-expression of free uracil DNA glycosylase inhibitor. Cell Res, 2017, 27:1289-1292

       7. Hu JH, Miller SM, Geurts MH, Tang W, Chen L, Sun N, Zeina CM, Gao X, Rees HA, Lin Z and Liu DR. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature, 2018

       8. Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV and Zhang F. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015, 163:759-771

       9. Yamano T, Nishimasu H, Zetsche B, Hirano H, Slaymaker IM, Li Y, Fedorova I, Nakane T, Makarova KS, Koonin EV, Ishitani R, Zhang F and Nureki O. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA. Cell, 2016, 165:949-962

       10. Dong D, Ren K, Qiu X, Zheng J, Guo M, Guan X, Liu H, Li N, Zhang B, Yang D, Ma C, Wang S, Wu D, Ma Y, Fan S, Wang J, Gao N and Huang Z. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA. Nature, 2016, 532:522-526

       11. Stella S, Alcon P and Montoya G. Structure of the Cpf1 endonuclease R-loop complex after target DNA cleavage. Nature, 2017, 546:559-563

       12. Swarts DC, van der Oost J and Jinek M. Structural Basis for Guide RNA Processing and Seed-Dependent DNA Targeting by CRISPR-Cas12a. Mol Cell, 2017, 66:221-233 e224

       13. Lei, L., Chen, H., Xue, W., Yang, B., Hu, B., Wei, J., ... & Yan, L. (2018). APOBEC3 induces mutations during repair of CRISPR–Cas9-generated DNA breaks. Nature structural & molecular biology, 25(1), 45.

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