細胞療法

       那還是在1968年，Steven Rosenberg覺(jué)得他遇到了一個(gè)極其罕見(jiàn)的病例。

       Rosenberg當時(shí)還是West Roxbury VA Hospital的一名住院醫。病人的右上腹疼痛難忍，Rosenberg經(jīng)過(guò)檢查之后發(fā)現他患有急性膽囊炎。沒(méi)什么嚴重的吧，他這樣想，進(jìn)行膽囊切除術(shù)就可以了。

       但在手術(shù)的時(shí)候，他發(fā)現病人的腹部有一道很長(cháng)的手術(shù)疤痕。Rosenberg問(wèn)他以前是不是接受過(guò)大型手術(shù)。“以前得過(guò)癌癥，”病人淡淡的說(shuō)：“那還是很多年前的事情了。”

       Rosenberg調出了他之前的病歷，發(fā)現他12年前曾因患有消化道癌癥在這家醫院進(jìn)行過(guò)手術(shù)，而且手術(shù)時(shí)癌癥就已經(jīng)轉移到肝 臟上。病歷中寫(xiě)道，醫生雖然能夠將一些大的腫瘤切除，但對小的轉移灶卻無(wú)能為力。當時(shí)醫生大概是覺(jué)得病人的生存期已經(jīng)不會(huì )很長(cháng)了，因此建議病人出院回家，享受生命的最后時(shí)光。

       然而讓Rosenberg意外的是，當他翻開(kāi)病歷的下一頁(yè)，他發(fā)現這位病人在三個(gè)月后再一次來(lái)到了這家醫院就診，接下來(lái)的一次是六個(gè)月之后。病歷中寫(xiě)著(zhù)，一年以后這位病人已經(jīng)能重返工作崗位了。

       Rosenberg覺(jué)得他對此只有兩種解釋。一是醫生診斷錯誤，也就是說(shuō)這位病人并不是癌癥患者，雖然存在這種可能性，但是概率并不高。而第二種可能是病人的癌癥經(jīng)歷了自發(fā)緩解過(guò)程而痊愈了。

       但這種情況發(fā)生的概率更低，因為直到Rosenberg遇到這位病人之前，醫學(xué)文獻中僅僅報道過(guò)四位這樣類(lèi)型的患者。每年罹患癌癥的人何止千千萬(wàn)，能夠自發(fā)緩解的人，大概只有其中的十萬(wàn)分之一。

       Rosenberg檢查了病人的原始病理報告以及組織樣本，排除了第一種可能。唯一的解釋只能是病人經(jīng)歷了自發(fā)緩解過(guò)程。但在當時(shí)來(lái)說(shuō)，這確實(shí)算得上是非常罕見(jiàn)的事情了。Rosenberg當時(shí)還只是一名住院醫，對他來(lái)說(shuō)遇見(jiàn)這樣的病人毫無(wú)疑問(wèn)是一種巨大的沖擊：這好像是魔法一樣，他曾這樣說(shuō)道。

       為了讓這一魔法能夠再次重現，Rosenberg進(jìn)行了一項聽(tīng)起來(lái)很簡(jiǎn)單的操作。他當時(shí)懷疑病人的血液中存在某種能夠抵抗癌癥的因子，而當時(shí)醫院恰好還有一位患有相同癌癥的病人與那位自發(fā)緩解的病人血型相同，因此Rosenberg在征得上級同意之后，將那位病情自發(fā)緩解的病人的部分血液輸入到了這位患者的體內。

       結果可想而知，奇跡并沒(méi)有發(fā)生。接受輸血的病人疾病很快進(jìn)展，不久之后便去世了。盡管沒(méi)能獲得成功，但Rosenberg卻變得十分著(zhù)迷于癌癥以及免疫學(xué)。為了更加深入地進(jìn)行研究，Rosenberg暫停了當時(shí)的外科手術(shù)培訓，去哈佛待了一年系統地學(xué)習免疫學(xué)知識。

       Rosenberg出生在一個(gè)傳統的猶太人移民家庭里。他的父母歷經(jīng)險阻從波蘭逃到了紐約，戰爭結束的時(shí)候，Rosenberg父母的大部分親人早已在大屠殺中喪生。那時(shí)的Rosenberg才六歲，一張張的明信片從歐洲寄到紐約，一次又一次地通知他們某位親人已經(jīng)在布痕瓦爾德或奧斯維辛的屠殺中喪生。

       這大概就是人世間的惡了吧?；蛟S是因為太小的年紀就經(jīng)歷過(guò)人性的陰暗面，Rosenberg從小就已經(jīng)很清楚將來(lái)要做什么：成為一名醫生，拯救患者的性命，而不是去害人。

       Rosenberg一直是一個(gè)工作狂，在他還年輕的時(shí)候，他曾想過(guò)跟當時(shí)還是女朋友的Alice O’Connell分手，因為他覺(jué)得戀愛(ài)會(huì )分散他進(jìn)行科研的精力。

       “我很喜歡夜晚，”Rosenberg在1992年出版的一本書(shū)The Transformed Cell中這樣寫(xiě)道。他還能回憶起年輕時(shí)深夜在實(shí)驗室工作的喜悅，喝著(zhù)在加熱器上已經(jīng)熱了幾個(gè)小時(shí)的早已煮的粘稠的咖啡，迎著(zhù)早晨的太陽(yáng)走出實(shí)驗室，大概這世上再找不到能與之媲美的滿(mǎn)足感了吧。

       Steven Rosenberg

       67號病人

       Rosenberg剛到NCI的時(shí)候，人們對于抗腫瘤免疫反應的了解還極為有限。十八世紀末十九世紀初，紐約的William Coley醫生曾使用Coley toxin來(lái)激活病人的免疫系統，以此來(lái)治療癌癥 (見(jiàn)：腫瘤免疫療法的誕生)。但由于療效難以重復，而且制備過(guò)程復雜，在化療以及放射療法出現之后Coley toxin就逐漸淡出了人們是視野。

       其實(shí)在Rosenberg剛參加工作的七十年代，依然有很多人不相信人體內的免疫反應能夠對抗腫瘤。然而Rosenberg卻一直堅信細胞免疫療法的潛力。那時(shí)Rosenberg也做過(guò)很多現在看來(lái)很蠢的研究，比如將豬的淋巴細胞輸入到人的體內。

       因為當時(shí)已經(jīng)有研究表明，將某些腫瘤抗原注射到兔子和豬的體內之后能夠引發(fā)動(dòng)物的免疫反應。Rosenberg認為既然動(dòng)物體內能夠存在對抗腫瘤細胞抗原的免疫反應，那么動(dòng)物血液中就有可能存在一些能夠對抗腫瘤的物質(zhì)。但與上一次相同，這一次的嘗試依然沒(méi)有成功。

       1976年，Robert Gallo實(shí)驗室發(fā)現IL-2能夠刺激T細胞的增殖 (見(jiàn)：抗擊艾滋病三十載：挫折、勇敢、堅韌與愛(ài)（一）)。Rosenberg希望能夠將這項發(fā)現應用到癌癥的治療上。于是他開(kāi)始嘗試將IL-2加入到小鼠T細胞的培養基中，在五天之后，T細胞數量增長(cháng)到了之前的30倍。

       IL-2是一個(gè)極好的研究工具。而Rosenberg當時(shí)也恰好需要這一工具，因為他的下一個(gè)免疫療法的方案是提取病人體內的T細胞，然后在體外擴增之后回輸到病人體內。

       Rosenberg認為，在所有從外周血提取的T細胞中，總有那么幾個(gè)細胞能夠識別腫瘤細胞。如果能夠擴增這類(lèi)細胞的話(huà)，將有可能有效的攻擊腫瘤細胞。

       其實(shí)Rosenberg和同事在之前的實(shí)驗中就證實(shí)了，將腫瘤組織與免疫細胞共培養之后再將這些免疫細胞暴露于其他腫瘤組織之后，這些細胞能夠在體外殺滅腫瘤細胞。而且他們同時(shí)也發(fā)現，將IL-2注射至小鼠體內之后能夠縮小小鼠的腫瘤。

       但是回輸使用IL-2培養過(guò)的T細胞，以及直接使用IL-2這兩種策略都沒(méi)能取得成功。而且更糟糕的是，Rosenberg發(fā)現IL-2的**非常大，能夠把每位接受治療的病人送進(jìn)ICU。

       盡管如此Rosenberg依然沒(méi)有放棄，他開(kāi)始嘗試使用這兩種治療手段的組合方案，也就是向病人體內回輸體外培養的T細胞，并同時(shí)使用IL-2。

       從1980年到1984年，Rosenberg嘗試了太多種治療方法，然而他在之前66位病人身上使用的方案都失敗了。但在1984年他遇到了第67位病人Linda Taylor，一位患有黑色素瘤的海軍軍官。

       Taylor是Rosenberg第一位接受這種組合療法的病人，而她卻被成功的治愈了。Taylor到現在依然還活著(zhù)。Taylor以及其他的一些人的成功治療，使Rosenberg以及IL-2療法登上了各大新聞的頭條，而他NCI的一些同事也開(kāi)始稱(chēng)呼他為Stevie Wonder。

       之后Rosenberg將數據發(fā)表 [1]。但后來(lái)人們卻發(fā)現該療法的作用其實(shí)沒(méi)那么大，因為該療法只能夠對很少一部分的黑色素瘤以及腎癌患者起效。

       在這之后Rosenberg的實(shí)驗室開(kāi)始嘗試從手術(shù)切除的腫瘤中提取其中浸潤的淋巴細胞 (這類(lèi)細胞被稱(chēng)為tumor-infiltrating lymphocytes)，并嘗試在體外擴增后回輸到病人的體內，并同時(shí)使用IL-2進(jìn)行治療。

       而除了療效的研究，當時(shí)Rosenberg實(shí)驗室還在進(jìn)行一項TIL的基礎研究：提高TIL細胞的體內存活時(shí)間，而這個(gè)任務(wù)也落在了Patrick Hwu的身上。

       飛馳的CAR

       Patrick Hwu 在1989年加入了Rosenberg的實(shí)驗室。他當時(shí)的第一項工作就是研究TIL細胞的存活時(shí)間。為了標記回輸至病人體內的T細胞，Hwu將編碼新霉素磷酸轉移酶的基因導入到了T細胞的基因組。

       該基因所表達的酶能夠保護T細胞不受新霉素的**作用影響。之后將細胞回輸至病人或小鼠體內。幾周之后再從體內提取T細胞，并向培養基中添加新霉素，之后再檢測存活細胞的數量。

       Hwu這項研究的結論很讓人意外，因為他發(fā)現這些回輸的T細胞在體內只能存活大約三周的時(shí)間。人體內的一些T細胞能夠存活長(cháng)達數年的時(shí)間，而這些回輸的T細胞卻只能存活三周的時(shí)間，這大概也能部分解釋為何TIL療法的療效不佳。

       但Hwu和同事認為他們或許能夠提高T細胞在體內的生存時(shí)間，這一靈感其實(shí)來(lái)源于骨髓移植。骨髓移植之前通常會(huì )使用氟達拉濱/環(huán)磷酰胺等清髓化療方案對病人進(jìn)行清髓預處理，以摧毀病人的免疫系統。以使之后輸入的免疫細胞就能夠有足夠的生存空間。

       雖然這種方式應用于TIL療法理論上來(lái)講是可行的，但對病人來(lái)說(shuō)也很危險。Hwu的同事基本都是外科醫生，只有Hwu一人是之前給病人使用過(guò)化療藥物的腫瘤學(xué)家。雖然他自己心里也很害怕病人出現問(wèn)題，但從某種意義上來(lái)說(shuō)，為了提高TIL的療效他必須進(jìn)行這種嘗試。

       但是讓他們意外的是，病人對氟達拉濱/環(huán)磷酰胺的耐受性并不差。而且他們發(fā)現進(jìn)行清髓化療之后再使用IL-2會(huì )使IL-2的**下降，并使部分病人的病情好轉。

       雖然這種方式取得了一定的成功，但到此時(shí)該療法治療黑色素瘤之外的其他類(lèi)型腫瘤的療效依然非常差。為何這一療法不能應用于其他類(lèi)型的腫瘤呢？Hwu決定采用其他手段來(lái)解決這一問(wèn)題，比如將TNF基因導入到TIL細胞中，使這些細胞在遷移至腫瘤位點(diǎn)之后再分泌TNF。

       但是這個(gè)研究項目進(jìn)展很緩慢。其實(shí)Hwu所進(jìn)行的這些TIL研究項目的難度都很高，因為Hwu當時(shí)發(fā)現TIL細胞的體外培養非常困難，而且TIL并不像其他一些類(lèi)型的細胞那樣容易表達外來(lái)基因，當時(shí)能夠提高轉染成功率的技術(shù)種類(lèi)也非常有限。

       Hwu的這個(gè)研究項目最終也沒(méi)取得成功，但他在TIL培養以及將外源基因導入T細胞的經(jīng)驗，卻對Zelig Eshhar當時(shí)進(jìn)行的一項研究產(chǎn)生了很大的影響。

       左：Patrick Hwu 右：Zelig Eshhar

       Zelig Eshhar 出生于以色列一個(gè)叫Rehovot的小鎮。Eshhar的博士以及博士后研究一直專(zhuān)注于免疫學(xué)領(lǐng)域的研究。他整天腦子里想的全是免疫，T細胞結構，抗體的功能。而有一天，Eshhar的腦子里出現了一個(gè)很奇怪的想法：T-body。

       Eshhar在研究T細胞受體(T cellreceptor, TCR)的結構的時(shí)候，他覺(jué)得TCR與抗體的結構和功能存在很多類(lèi)似的地方?？贵w是由B細胞(漿細胞)制造的，而TCR則存在于T細胞上。從結構上講，TCR由alfa和beta鏈組成，抗體由重鏈以及輕鏈組成，兩者都包含恒定區以及可變區。而從功能上講，TCR以及抗體都有抗原識別的功能。而且表達抗體和TCR的基因屬于同一個(gè)基因家族。

       但TCR與抗體識別抗原的方式存在明顯差異，因為抗體能夠識別抗原的固有形態(tài)，而且具有較高的親和性，但TCR只能夠識別MHC遞呈的抗原片段。

       如果將TCR的可變區替換為抗體的可變區會(huì )產(chǎn)生什么后果呢 (TCR-AntiBODY, T-body)？是否會(huì )將抗體的抗原特異性轉移到T細胞上呢？

       該嵌合結構的抗原受體也同時(shí)包含TCR細胞外的恒定區，以及跨膜區和TCR的胞內結構區，因此該受體也應該能夠誘導T細胞增殖，介導白介素生成以及使靶細胞裂解。

       Eshhar也證實(shí)了這一想法的可行性。Eshhar實(shí)驗室將TNP (2，4，6-三硝基苯) 抗體的可變區移植到了TCR的恒定區上，并證明了該嵌合抗原受體 (chimeric antigen receptor, CAR) 受體具有類(lèi)似該抗體的特異性，并能夠以非MHC限制性的方式結合TNP抗原，并介導白介素生成和靶細胞裂解 [2]。

       Eshhar這項研究的目的只是想驗證是否能夠改變T細胞受體的抗原特異性，并介導其相應的細胞殺傷作用。而將其用于腫瘤治療領(lǐng)域的設想其實(shí)是后來(lái)才有的想法。因為當時(shí)利用單克隆抗體治療癌癥的研究已經(jīng)比較多了，而Eshhar的技術(shù)理論上能夠克服TCR識別腫瘤抗原的缺陷，將TCR的可變區替換為靶向腫瘤抗原的抗體可變區。

       而如果將該技術(shù)應用于疾病治療領(lǐng)域的話(huà)，Eshhar還需要對以上技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)。因為他之前使用的永生化的細胞或雜交瘤細胞并不能直接應用于疾病的治療。

       但Eshhar在將嵌合基因導入到原代T細胞的過(guò)程中卻遇到了困難。而Hwu對Eshhar遇到的困難一點(diǎn)也不感到意外，因為淋巴細胞本來(lái)就很難表達外源基因，而Hwu之前導入TNF基因的經(jīng)驗卻給了他很多經(jīng)驗。

       為了能夠在原代T細胞中穩定的表達嵌合抗原受體基因，Eshhar決定與Hwu所在的實(shí)驗室合作。他們使用了來(lái)源于抗體的單鏈抗體片段(single-chain variable fragment, scFv)來(lái)解決嵌合抗原表達穩定性的問(wèn)題。

       而先前的實(shí)驗也證明了scFv與天然Fab片段的結合活性與特異性類(lèi)似。而且他們使用了Fc受體的γ亞基來(lái)轉導抗原結合信號，(除此之外，1991年的時(shí)候Arthur Weiss實(shí)驗室證明了包含CD8, and the CD3ζ的CAR也足以激活T細胞)。

       Hwu等人構建了作用于三種不同靶標的嵌合抗原受體(chimeric antigenreceptor, CAR)，一種是靶向乳腺癌細胞，一種是結腸癌，一種是卵巢癌。然后他們將這些系統導入到靶向黑色素瘤的TIL中。最后他們也證明了來(lái)源于MOv18抗體的CAR-T細胞能夠有效裂解相應的卵巢癌細胞。

       1993年，Hwu以及Eshhar等人將該數據整理成論文發(fā)表 [3]。這篇文章也成了CAR-T領(lǐng)域的里程碑式的文章。

       但在接下來(lái)的十年里，CAR-T療法卻經(jīng)歷了許多的磨難與挫折。

       上世紀九十年代，在Rosenberg實(shí)驗室所在街道的另一側，位于貝塞斯達的海軍醫學(xué)研究所里，Carl June同樣也在研究CAR-T。

    （未完待續）