由于環(huán)境與生活方式改變、生育年齡后延以及癌癥治療等諸多因素，近年來(lái)女性生育力明顯下降，我國不孕不育率已高達15%-20%，其中女性原因約占50%。排卵及卵成熟異常、卵巢功能低下等卵巢功能障礙是導致女性不孕的重要原因，人類(lèi)卵母細胞體外成熟、卵泡體外培養體系等生育力保護保存技術(shù)還面臨很多難題。卵泡是維持女性卵巢功能的基本單元，而卵泡正常發(fā)育與成熟的分子機制尚未闡明，導致臨床上缺乏診療卵巢功能障礙的有效手段和保護生育力的有效措施。
胎兒期卵泡發(fā)生和青春期后卵泡發(fā)育是女性卵泡發(fā)育的兩個(gè)重要階段，前者與卵巢儲備密切相關(guān)，后者與受精、生育關(guān)系緊密。女性在胎兒期20周時(shí)，卵泡數量高達數百萬(wàn)，但是在整個(gè)生育周期僅有400個(gè)左右發(fā)育為成熟的卵泡、排卵，99.9％的卵泡發(fā)生閉鎖和丟失。因此，卵泡發(fā)生、發(fā)育與成熟的分子機制的探討對認識女性生育力維持與改善至關(guān)重要。小鼠卵泡發(fā)育的基因調控網(wǎng)絡(luò )研究已有多篇報道，人類(lèi)與嚙齒類(lèi)動(dòng)物的卵泡發(fā)育時(shí)程與排卵模式都有種屬差異，所以研究人類(lèi)卵泡發(fā)育對于揭示女性生育力建立、維持與下降機制具有重要的意義。既往人類(lèi)卵泡研究主要將卵巢組織或多個(gè)卵泡作為整體進(jìn)行研究，而不同卵泡異質(zhì)性較大，不能體現卵母細胞與其周?chē)w粒細胞各自功能與相互作用機制。因此，需要從單個(gè)卵泡水平分別揭示卵母細胞與顆粒細胞基因表達特征及相互作用信號通路。
2018年11月21日，北京大學(xué)第三醫院?jiǎn)探茉菏繄F隊在Molecular Cell發(fā)表題為T(mén)ranscriptome Landscape of Human Folliculogenesis Reveals Oocytes and Granulosa Cells Interactions（人類(lèi)卵泡發(fā)育過(guò)程轉錄調控及卵母細胞與顆粒細胞的相互作用）的研究論文，系統解析了人類(lèi)卵泡發(fā)育過(guò)程中轉錄組動(dòng)態(tài)全景圖及卵母細胞-顆粒細胞相互作用的基因表達調控規律。這是該團隊在人類(lèi)生殖細胞發(fā)育研究領(lǐng)域里取得的又一重要進(jìn)展。
本研究中，課題組利用機械法和酶消化法處理人類(lèi)卵巢組織并分離得到發(fā)育各階段的單個(gè)卵泡（原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡、排卵前卵泡），進(jìn)一步消化得到單個(gè)卵母細胞和顆粒細胞，進(jìn)行轉錄組測序，繪制了人類(lèi)卵泡發(fā)育過(guò)程中轉錄組動(dòng)態(tài)全景圖并解析了卵母細胞-顆粒細胞互作規律。同時(shí)進(jìn)行了小鼠與人類(lèi)卵母細胞轉錄組數據對比分析，發(fā)現了參與調控卵泡發(fā)育的保守性和物種特異性基因（圖1）。
圖1 人卵泡發(fā)育過(guò)程基因表達調控
通過(guò)此項研究，研究人員發(fā)現：
（1）轉錄組顯示卵泡可聚為五個(gè)類(lèi)群，原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡及排卵前卵泡，并與卵泡形態(tài)學(xué)分類(lèi)一致。卵母細胞及顆粒細胞各自差異基因表達模式具有顯著(zhù)的發(fā)育階段特征。隨著(zhù)卵泡發(fā)育，卵母細胞減數分裂相關(guān)基因表達水平總體呈逐步上調趨勢。而顆粒細胞有絲分裂相關(guān)基因表達水平從原始卵泡到竇卵泡階段總體呈逐步上調趨勢，而從竇卵泡到排卵前卵泡階段表達下調。
（2）卵泡發(fā)育過(guò)程卵母細胞與顆粒細胞存在階段特異表達基因。這些篩選出的階段特異性表達基因可作為每個(gè)階段卵母細胞與顆粒細胞的潛在特異性標志物，有助于建立臨床上評價(jià)卵泡發(fā)育的客觀(guān)標準，為準確預測卵巢儲備、監測生育力水平、篩選卵母細胞成熟的標志物提供了線(xiàn)索。
（3）卵泡激活的關(guān)鍵步驟是原始卵泡到初級卵泡的轉變。本研究提示Insulin、GnRH、Neurotrophin和mTOR信號通路相關(guān)基因在初級卵泡中卵母細胞及顆粒細胞中均顯著(zhù)上調，可能參與原始卵泡階段到初級卵泡階段的激活調控，是完善體外卵泡培養體系的潛在靶點(diǎn)。
（4） 闡述人類(lèi)卵泡發(fā)育過(guò)程卵母細胞與顆粒細胞的相互作用機制。研究發(fā)現NOTCH信號通路配體DLL3和JAG2主要在卵母細胞中表達，其受體NOTCH 2、NOTCH 3和下游靶基因HES1在相應的顆粒細胞中高表達，提示NOTCH信號介導了卵母細胞調控顆粒細胞增殖和分化的事件。
（5） 揭示了在人與小鼠卵泡發(fā)育過(guò)程中基因表達具有保守性和特異性。研究發(fā)現在人和小鼠卵母細胞中有8838個(gè)共表達基因（5923個(gè)基因為管家基因）。在非管家基因中，1557個(gè)基因在人不同階段的卵母細胞中穩定表達，1358個(gè)基因具階段特異性。進(jìn)一步發(fā)現，人和小鼠卵母細胞發(fā)育過(guò)程中，POUF5、GJC1、TEAD2及BMP15等基因具有不同的表達模式，顯示出人和小鼠的差異；HAS3、HTR5A、SNPH及NRAP等基因在具有相同的表達模式，顯示出人和小鼠具有一定的保守性。
綜上，該研究繪制了人類(lèi)卵泡發(fā)育過(guò)程的單細胞轉錄組圖譜，揭示了卵母細胞及顆粒細胞的轉錄組動(dòng)態(tài)變化，闡釋不同發(fā)育階段卵母細胞與顆粒細胞轉錄組特征及互作規律，為尋找新的促進(jìn)體外卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟的方法奠定了基礎。同時(shí)該研究有助于開(kāi)發(fā)生育力下降早期監測的分子標記、改進(jìn)r生育力保護保存臨床治療方案，最終提高優(yōu)生優(yōu)育水平。
據悉，北京大學(xué)第三醫院?jiǎn)探芙淌?、嚴杰副研究員與閆麗盈研究員為論文共同通訊作者。北京大學(xué)第三醫院張曜耀博士、北大清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士研究生嚴智強以及北京大學(xué)第三醫院碩士研究生覃清圓為并列第一作者。
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