免疫是人類(lèi)健康的第一道防線(xiàn)，是防衛病原體入侵最有效的武器。今天談?wù)劶毦蚬派拿庖?。細菌免疫系統CRISPR-Cas的發(fā)現引發(fā)了技術(shù)革命浪潮并產(chǎn)生了極大的社會(huì )影響。
新發(fā)現的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9，使得CRISPR系統在病原體的快速診斷和腫瘤基因檢測領(lǐng)域的應用成為可能，本期我們重點(diǎn)關(guān)注“新魔剪”Cas12a，看看它如何瘋狂切割單鏈DNA，實(shí)現對腫瘤基因或特定病原體的檢測。
CRISPR-Cas系統背景回放
面對噬菌體的威脅，細菌進(jìn)化出了一套專(zhuān)門(mén)針對噬菌體或外源性遺傳物質(zhì)的CRISPR-Cas免疫系統。CRISPR全稱(chēng)為“簇狀、規律間隔的、短回文重復序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是由眾多短而保守的重復序列區（repeat）和間隔區（spacer）組成。如圖1所示： Repeat是細菌固有序列，能夠同時(shí)結合Cas蛋白和spacer的序列，而spacer則是細菌（或是其祖先）感染過(guò)的病毒序列。一旦噬菌體感染發(fā)生，絕大多數的細菌死亡，極少部分的細菌由于其基因變異得以生存。這些細菌中的一部分，將噬菌體的DNA序列切割后，插入repeat區域中，形成spacer，從而獲得類(lèi)似高等生物“免疫記憶”的能力。
隨著(zhù)CRISPR-Cas機理的逐步揭示和新的Cas酶（Cas12/Cas13/Cas14）的發(fā)現，科學(xué)家們發(fā)現這個(gè)系統非常強大，可以精準高效地實(shí)現基因編輯，比如對某個(gè)基因的敲除、插入和替換等。而CRISPR系統的序列特異性識別能力已經(jīng)被應用在越來(lái)越多的領(lǐng)域，如醫藥，食品，農業(yè)和工業(yè)生物技術(shù)等，這些應用很大程度上都是以Cas9為基礎進(jìn)行開(kāi)發(fā)的，而新發(fā)現的Cas12/Cas13/Cas14不同于Cas9，使得CRISPR系統在病原體的快速診斷和腫瘤基因檢測領(lǐng)域的應用成為可能。
Cas12a-單鏈DNA的“新魔剪”
今年4月，有CRISPR女神之稱(chēng)的Jennifer Doudna 教授在《Science》撰文指出Cas12酶家族在gRNA的引導下與目標序列結合以后，便會(huì )切換為激活狀態(tài)，瘋狂的切割體系內其它的單鏈DNA。Cas12a這一特點(diǎn)可被用于分子診斷領(lǐng)域，實(shí)現對腫瘤基因或特定病原體的檢測。在體系內加入含有報告基團的單鏈底物后，如果Cas12a識別到靶序列（目標病原體或腫瘤基因）的存在，就會(huì )切割單鏈底物從而釋放熒光報告基團。
但是如果樣本中的目標基因含量非常少，Cas12a與gRNA復合物匹配到需檢測靶序列的概率很低。此時(shí)就需要先擴增靶序列，提高需要檢測底物的豐度。PCR（聚合酶鏈式反應）是常用于這一目的擴增手段，但是需要專(zhuān)門(mén)的PCR儀進(jìn)行溫控反應。而另外一種信號擴增技術(shù)——重組聚合酶擴增（RPA），可以在恒溫狀態(tài)下實(shí)現信號的擴增，而不需要復雜的升溫降溫過(guò)程。Doudna教授創(chuàng )新性的將Cas12a靶向切割單鏈DNA的特性與RPA技術(shù)聯(lián)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)了一種名為DETECTR的技術(shù)（DNA Endonuclease-Targeted Crispr Trans Reporter）。研究結果表明，肛拭子取樣后等溫擴增10分鐘，使用Cas12a系統對擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，可以在1小時(shí)內檢測到人乳頭瘤病毒（HPV）并準確區分兩種相似的亞型，HPV16和HPV18。DETECTR技術(shù)的開(kāi)發(fā)為實(shí)現病原體或腫瘤基因的即時(shí)檢驗（POCT） 又提供了一個(gè)強有力的支撐平臺。
研究者基于CRISPR-Cas12a聯(lián)合 RPA技術(shù)開(kāi)發(fā)的
那CRISPR-Cas12a與CRISPR-Cas9有什么區別呢？ Cas9是最早發(fā)現的Cas酶之一，也是目前為止研究最深入和應用最廣泛的Cas酶，在基因編輯、疾病治療等方面的應用前景巨大。然而CRISPR-Cas9缺乏切割單鏈核酸的酶活結構域，無(wú)法用于體外檢測。而Cas12/13/14則普遍存在第二個(gè)酶活結構域，當蛋白正確結合到靶向序列時(shí)，能夠激活這一結構域，切割探針小分子，實(shí)現從待檢序列信息到熒光信號的轉化?；谒鼈兊倪@一特點(diǎn)，在醫學(xué)檢測領(lǐng)域需要靶向檢測已知序列的情況下，能夠實(shí)現普通實(shí)時(shí)定量PCR所無(wú)法達到的靈敏度，擺脫對實(shí)時(shí)定量PCR儀的依賴(lài)。
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