早些時(shí)候，藥物發(fā)現主要依賴(lài)于偶然的現象和臨床醫生的經(jīng)驗，現代藥物開(kāi)發(fā)的篩選模式最初始于Paul Ehrlich對抗梅毒 藥物的系統化篩選，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，目前的篩選模式和方法早已發(fā)生了巨大的變化，但系統篩選這一核心思想卻并未改變。受限于生物技術(shù)的發(fā)展水平，早些時(shí)候藥物篩選主要依賴(lài)于表型篩選模式，而且每次可以篩選的化合物數量較少。隨著(zhù)生物科技的快速發(fā)展，PCR、DNA重組、轉染等技術(shù)的出現，極大的促進(jìn)了藥物篩選的效率。伴隨著(zhù)新技術(shù)的出現，篩選數據的數量和復雜程度也直線(xiàn)上升，在規范化的研發(fā)模式中，藥物開(kāi)發(fā)分工也越來(lái)越細化，負責化合物優(yōu)化的藥物化學(xué)家可能并沒(méi)有相關(guān)的生物學(xué)或者分子生物學(xué)背景，因此對化合物篩選中的一些數據或者術(shù)語(yǔ)有清晰的認知和了解，對化合物的優(yōu)化非常有必要。

       篩選的類(lèi)型

       目前化合物的篩選主要有兩種模式：表型篩選和基于靶點(diǎn)的藥物篩選！這兩種篩選思路各有優(yōu)劣，總體上呈互補關(guān)系?；诎悬c(diǎn)的藥物篩選主要用于靶點(diǎn)-疾病相互作用明確，將靶點(diǎn)蛋白通過(guò)現代生物技術(shù)制備出來(lái)，然后測試其與待測化合物的相互作用強弱，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是效率高、化合物作用原理清晰，但是前期需要大量的投入以確證目標靶點(diǎn)與疾病的相互關(guān)系。表型篩選通常以細胞作為篩選工具，優(yōu)點(diǎn)是對于靶點(diǎn)還不明晰，或靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系還不明確時(shí)的藥物開(kāi)發(fā)，具有非常好的效果，常用于First in class藥物的研發(fā)，缺點(diǎn)在于作用機制不明晰，因此后期還需要復雜的機制研究。表型篩選盛行于藥物開(kāi)發(fā)的早期階段，但是現在越來(lái)越多的制藥公司對這一方法青睞有加，主要是因為它在新穎藥物開(kāi)發(fā)中表現出來(lái)的巨大優(yōu)勢。

       化合物的篩選是一項復雜的過(guò)程，會(huì )產(chǎn)生很多數據，對這些數據進(jìn)行有效的辨識和分析，是項目成功的重要條件，以下對幾種比較重要的數據做一簡(jiǎn)要介紹。

       濃度-響應曲線(xiàn)和IC50

       在開(kāi)始篩選時(shí)，通常會(huì )設置一個(gè)固定的濃度或者數值，比如說(shuō)對于給定作用靶點(diǎn)，半數抑制濃度要小于1 uM，這樣去除大部分效果差或者沒(méi)有效果的化合物，將通過(guò)初篩的化合物，再重復測試若干個(gè)不同濃度下的響應數據，通常為8到12個(gè)1/2Log（濃度）梯度，將得到的濃度-響應信號強度連成一條曲線(xiàn)，就得到了化合物的濃度響應曲線(xiàn)，根據此曲線(xiàn)可以判斷評價(jià)各個(gè)化合物。

       在化合物樣本量較小的時(shí)候，可以采用濃度響應曲線(xiàn)來(lái)評價(jià)化合物的活性，但是當化合物的數量很多的時(shí)候，繪制濃度響應曲線(xiàn)是不可能的，工作量太大，此時(shí)通常采用半數抑制濃度IC50。IC50是指抑制劑（酶拮抗劑、受體）將給定刺激所產(chǎn)生效應減小一半時(shí)的濃度，這個(gè)數值的意義由活性測試本身所確定，比如說(shuō)基于酶活性的測試，IC50表示化合物對酶活性的抑制效果；如果是GPCR的活性測試中，只是表示化合物對GPCR**標記配體的取代效果，并不代表其產(chǎn)生的生理活性。另外，測試條件，如底物/配體濃度、輔因子濃度以及初始刺激強度等也會(huì )影響結果，因此，對于IC50這個(gè)數值的理解，要根據具體的測試條件以及數據采集方式來(lái)定。

       “常數”類(lèi)指標: Kd 、Ki、KB、KA、Km

       雖說(shuō)IC50是一個(gè)非常重要的化合物活性比較工具，但是仍然有局限性，帶有一定的經(jīng)驗性，而且不能體現化合物與靶點(diǎn)生物大分子結合能力的強弱，這時(shí)需要引入一個(gè)新的參數：化合物解離常數K，化合物解離常數的定義是：測試體系中【配體的濃度】與【蛋白濃度】乘積除以體系中的【靶點(diǎn)-化合物結合物】的濃度，其意義為半數靶點(diǎn)結合位點(diǎn)被化合物結合時(shí)，所需要的化合物濃度，常數K濃度越低，則表明化合物與靶點(diǎn)的結合性越強，反之則越弱。需要注意的是，所有的平衡解離常數K值均帶有濃度單位，

       在實(shí)際應用中，分別以不同的下標來(lái)表示不同的測試。Kd表示采用**標記配體與靶點(diǎn)結合的平衡解離常數。KB表示在拮抗劑-受體復合物的平衡解離常數，在效能測試中測定，表示對生理反應的拮抗作用。KA表示激動(dòng)劑-受體復合體的平衡解離常數。Ki則表示在生化結合測試中或酶測試中拮抗劑-受體復合物的平衡解離常數。Km全稱(chēng)為米歇利斯常數，也稱(chēng)為米氏常數，通常用于表示反應速率為值Vmax一半時(shí)，底物的濃度，常用于衡量底物對酶的結合性。

       結合位點(diǎn)數Bmax

       理想模型下，化合物與靶點(diǎn)分子的結合位置僅有一個(gè)，然而實(shí)際情況并非如此。將目標受體膜或組織在不同濃度的**配體環(huán)境下培養一段時(shí)間后，過(guò)濾除去未結合的配體，將已結合的與自由配體的比值（bound/free）為縱坐標，結合配體的數目（bound）為橫坐標，得到一條直線(xiàn)，稱(chēng)之為Scatchard作圖（Scatchard plot），其斜率為平衡解離常數的負倒數，與橫坐標的截距則為單位質(zhì)量的組織或蛋白的結合位點(diǎn)數目Bmax。然后將**標記的配體替換為待測化合物，重復同樣的操作，得到另外一條曲線(xiàn)，若Bmax保持不變，而直線(xiàn)的斜率減小，則表示待測化合物為競爭性作用。當直線(xiàn)的斜率不變而B(niǎo)max減小，則表示待測化合物為非競爭性作用。

       半效能濃度與效能：EC50 & Emax

       IC50、平衡解離常數K并不能表示待測化合物所產(chǎn)生的生理反應情況，例如在GPCR的體外測試中，這些數值只是表明該化合物將GPCR受體結合位點(diǎn)上天然配體取代掉能力的強弱，并不能體現使GPCR受體產(chǎn)生相應生物效應能力的情況，因此還需要對化合物做功能測試，和濃度-響應曲線(xiàn)的測試方法類(lèi)似，通常選取8到12個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度1/2Log（濃度）差異，對于GPCR受體來(lái)說(shuō)，一般通過(guò)測定第二信使的濃度來(lái)研究化合物的效能，通常，以天然配體與靶點(diǎn)結合后產(chǎn)生的效果表示為效能，待測化合物的效能可能大于也可能小于天然配體，將產(chǎn)生效應一半時(shí)的濃度，稱(chēng)為EC50，將產(chǎn)生的效應與天然配體所產(chǎn)生效應的比值稱(chēng)為效能Emax。值得注意的是，在不清楚化合物的效能Emax時(shí)，僅使用EC50來(lái)比較化合物的活性情況是毫無(wú)意義的。上圖（圖六）中化合物2和天然配體的EC50值一樣，而且化合物1的EC50值比天然配體的還要高，但不管化合物1還是化合物2，它們所能產(chǎn)生的效能均沒(méi)有天然配體的高。

       激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、拮抗劑、變構調節劑以及反向激動(dòng)劑

       通常來(lái)說(shuō)，對于簡(jiǎn)單的靶點(diǎn)，化合物的作用效果比較單一，也較容易理解，如酶腸肽酶、糖苷水解酶等，僅表現為抑制作用，但是對于比較復雜的靶點(diǎn)，如GPCR、核受體等，涉及到一系列的下游信號轉導，化合物所表現出來(lái)的效果各有差異，相對于天然的配體，化合物所產(chǎn)生的生物效果可能比天然配體的效果強，也可能比較弱，也可能阻斷下游信號通路，因此，對于上述幾種作用結果，可分為激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、拮抗劑、變構調節劑以及反向激動(dòng)劑等幾種。

       將能夠引起和天然配體一樣效應的化合物稱(chēng)之為激動(dòng)劑，對于雖然能夠產(chǎn)生和天然配體一樣效應的化合物，但是其效果并沒(méi)有天然配體的效果強，稱(chēng)之為部分激動(dòng)劑。對于那些既不會(huì )產(chǎn)生激動(dòng)效應、也不會(huì )產(chǎn)生抑制效應，但是能夠和靶點(diǎn)相結合、結合能力比天然配體強的化合物，稱(chēng)之為中性激動(dòng)劑，需要了解的是，雖然中性激動(dòng)劑不會(huì )產(chǎn)生正面或者負面的效應，但是它占據了結合位點(diǎn)，因而表現出“沉默效應”，也稱(chēng)之為拮抗劑。

       靶點(diǎn)生物大分子并不是想象中的只有“開(kāi)”和“關(guān)”兩種狀態(tài)，本質(zhì)上，這些系統處于一個(gè)平衡中，以GPCR為例來(lái)說(shuō)明：當未有天然配體或者激動(dòng)劑存在時(shí)，一部分GPCR受體于激活狀態(tài)時(shí)的構象，而一部分在表現為靜息狀態(tài)下的構象，只不過(guò)靜息狀態(tài)的構型處于主導地位，但絕不是全都是靜息狀態(tài)，此時(shí)所表現出來(lái)的活性稱(chēng)之為“基底活性（BasalActivity）”，加入激動(dòng)劑后，使得該平衡中處于激活狀態(tài)的受體數量增加，總體上表現出激活作用；當加入的化合物能夠穩定GPCR的靜息構型，平衡中處于靜息狀態(tài)的受體數量增加，表現出與激活狀態(tài)時(shí)相反的效應，那么就稱(chēng)該化合物為“反向激動(dòng)劑”。

       調節靶點(diǎn)（生物大分子）性質(zhì)最直接的方式就是設計出合適的化合物，與靶點(diǎn)上天然配體相結合的位置相互作用，而這個(gè)位置稱(chēng)之為正構結合位點(diǎn)，但是也存在其他的結合位點(diǎn)，通常該位點(diǎn)和正構結合位點(diǎn)相距較遠，小分子化合物與該位點(diǎn)結合，能夠改變靶點(diǎn)分子的構象，增強靶點(diǎn)功能的化合物稱(chēng)為正向變構調節劑，反之則稱(chēng)為負向變構調節劑。在很多情況下，如果缺失配體，僅有變構調節劑的存在不會(huì )影響生物系統的功能，以GPCR為例說(shuō)明，當有正向變構劑存在時(shí)，能夠促進(jìn)配體與GPCR受體的結合，從而產(chǎn)生相應的調節響應，但是如果沒(méi)有配體存在，僅有變構調節劑，則GPCR受體不能被激活。苯二氮卓類(lèi)藥物就屬于伽馬氨基丁酸受體變構調節劑，目前已有30多種苯二氮卓類(lèi)藥物，廣泛用于焦慮、驚慌癥、失眠等疾病的治療。

       儲備受體

       一般我們都會(huì )認為，受體和下游的信號傳導系統存在著(zhù)一一對應關(guān)系，按照此假設，如果想要產(chǎn)生的信號響應，則需要將細胞表面的受體全部激活才行，然而事實(shí)并非如此，實(shí)際上細胞表面的受體僅需被激活一部分，就能達到的信號響應，此時(shí)，胞內的信號傳導已達到飽和狀態(tài)，因此，被激活受體的百分比相比實(shí)際的數量更有意義，舉例來(lái)說(shuō)，假如在不同的組織細胞表面表達了同一種受體，但是其中一個(gè)組織的細胞（A細胞）表面受體表達數量較另一個(gè)（B細胞）更多，在同樣的配體濃度下，B細胞表面約十分之一的受體被激活，而A細胞表面則僅有百分之一的受體被激活，此時(shí)A細胞僅能產(chǎn)生較小的細胞響應，而B(niǎo)細胞則表現出的響應，由此，可以選擇性的激活B而使A處于沉默狀態(tài)，但如果目標調節是A，則B細胞就會(huì )不可避免的被激活。如果采用受體過(guò)表達的細胞做體外篩選，得到的化合物在體內實(shí)驗時(shí)，其活性會(huì )比體外測試的更強，因為正常細胞表面的受體含量遠低于篩選模型細胞。

       總結

       化合物的體外篩選是藥物開(kāi)發(fā)最起始也是非常重要的一個(gè)階段，“讀懂”測試數據是決策的基本條件，只有各個(gè)指標在一個(gè)合理的區間內才具有進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化的價(jià)值。