免疫療法是當下腫瘤治療領(lǐng)域前景的發(fā)展方向之一。隨著(zhù)PD-(L)1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑應用范圍逐漸擴大，CAR-T療法研究不斷出現新的進(jìn)展，CAR-T療法作為有別于傳統藥物的“活藥”，不僅對復發(fā)、難治性腫瘤患者表現出了突破性療效，其生產(chǎn)體系和使用場(chǎng)景也有別于普通藥物。鑒于當下生物技術(shù)的更新速度，預計CAR-T療法還將帶給市場(chǎng)更多驚喜。本報告擬從CAR-T療法技術(shù)基礎入手，分析CAR-T療法的局限性及研發(fā)方向、行業(yè)發(fā)展情況、研發(fā)情況與如何選擇國內標的、投融資情況及行業(yè)總結。

      一、CAR-T的靶向抗原

      CAR-T技術(shù)是靶向某一種抗原，而不是針對單一腫瘤疾病，因此靶點(diǎn)的選擇是CAR-T有效性和安全性的基礎。CAR-T靶向的腫瘤抗原可分為兩類(lèi)：

      腫瘤特異性抗原：特異性地在腫瘤細胞表面表達，在正常組織中無(wú)表達，這是最理想的抗原。靶點(diǎn)抗原的特異性越高，CAR-T細胞就可越專(zhuān)一地針對特定的腫瘤細胞，對正常細胞不作用，從而降低機體不良反應。這種理想的抗原并不多，目前受到關(guān)注的有表皮生長(cháng)因子受體EFGRvIII和前列腺特異性膜抗原PSMA等。

      腫瘤相關(guān)抗原：在腫瘤細胞表面過(guò)度表達，在正常組織中低表達，目前大部分應用的腫瘤抗原靶點(diǎn)都是這種；腫瘤相關(guān)抗原可分為幾種不同類(lèi)型：免疫細胞的抗原通常與其抗原分化簇（CD）分型有關(guān)，包括CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD269（BCMA）等；參與生長(cháng)和分化信號的抗原，包括癌胚抗原（CEA）、表皮生長(cháng)因子受體（EGFR、HER2）、酪氨酸激酶受體（EPHA2）等；參與腫瘤血管生成的抗原，包括血管內皮生長(cháng)因子（VEGF）、VEGF受體（VEGFR）等；腫瘤支撐結構的腫瘤間質(zhì)和細胞外基質(zhì)抗原，包括纖維細胞激活蛋白（FAP）、tenascin蛋白等。

      從研發(fā)進(jìn)展來(lái)看，應用于臨床最成功的案例是以CD19為靶點(diǎn)構建的CAR-T（此前諾華和Kite Pharma獲批的兩個(gè)CAR-T 產(chǎn)品均以CD19為靶點(diǎn)），主要有兩方面的原因，一方面，CD19抗原雖然是腫瘤相關(guān)抗原，但是它只在正常的B細胞和腫瘤B細胞上表達，以CD19為靶點(diǎn)的CAR-T會(huì )殺傷所有B細胞，當B細胞都被殺死之后，造血干細胞可以補充新的正常B細胞，患者也可以通過(guò)輸入免疫球蛋白來(lái)補償正常B細胞損傷所產(chǎn)生的影響，因此即使清除了患者體內的B細胞，通常也不會(huì )對患者的健康產(chǎn)生嚴重影響；另一方面，回輸的CAR-T細胞自然歸巢于血液器官，如血液、骨髓和淋巴結等，CAR-T與B細胞接觸充分，有效作用殺傷。雖然以CD19為靶點(diǎn)的CAR-T細胞治療效果很好，但是其適應癥也局限在B細胞相關(guān)的血液腫瘤中，比如B系淋巴細胞白血?。毙?、慢性）以及非霍奇金淋巴瘤（彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤等）。

      除了靶點(diǎn)CD19，BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123等靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)均逐漸把CAR-T拓展到更廣泛的血液腫瘤治療上。這些靶點(diǎn)中，BCMA正在成為CAR-T治療的熱門(mén)靶點(diǎn)。BCMA作為一種極為重要的B細胞生物標志物，之所以引起極大關(guān)注，是因為它的RNA幾乎總是在多發(fā)性骨髓瘤細胞中發(fā)現，并且該蛋白也存在于多發(fā)性骨髓瘤患者惡性漿細胞表面，而且，與CD19靶點(diǎn)類(lèi)似，BCMA-CAR-T治療后雖然也殺傷了正常的漿細胞，但患者可以通過(guò)免疫球蛋白給藥來(lái)維持機體免疫力。雖然目前尚無(wú)相關(guān)產(chǎn)品獲批上市，但在臨床試驗中，靶向BCMA的CAR-T療法用于多發(fā)性骨髓瘤的治療已經(jīng)獲得了很大的成功。美國bluebird bio和南京傳奇生物的靶向BCMA治療多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T產(chǎn)品在臨床試驗中均達到了較高的客觀(guān)緩解率（bluebird： 94%，南京傳奇：）。

      實(shí)體瘤靶點(diǎn)的研發(fā)較為困難，主要是因為以下三點(diǎn)：第一，幾乎所有的靶點(diǎn)都是腫瘤相關(guān)抗原，CAR-T細胞在殺傷腫瘤細胞時(shí)容易誤傷正常組織，發(fā)生“脫靶**”；第二，實(shí)體瘤是一群異質(zhì)性腫瘤細胞，不同突變腫瘤細胞上的靶點(diǎn)不一樣，單一種類(lèi)的CAR-T很難殺光全部腫瘤細胞；第三，實(shí)體腫瘤就像獨立的器官一樣，擁有自己的血管、淋巴管、結締組織等，周?chē)臏囟?、pH、滲透壓、細胞因子等微環(huán)境都與正常組織不一樣，正常的免疫細胞以及CAR-T等都可能會(huì )被腫瘤微環(huán)境所抑制，不能發(fā)揮免疫反應。

      2018年中國腫瘤登記年報數據顯示，我國發(fā)病率的前10種癌癥均為實(shí)體瘤，占全部癌癥的比例高達77%。2017年美國癌癥年報數據也顯示，每年新增癌癥病例中僅有不到5%的比例是血液腫瘤。因此，CAR-T實(shí)體瘤靶點(diǎn)的研發(fā)空間還非常巨大，任重道遠。

      據Cell Trials的統計，截至2017年10月，全球大約50%的 CAR-T臨床試驗針對CD19靶向抗原，另有一小部分（約6%）使用的是由CD19與另一抗原組成的組合抗原。除卻CD19，CAR-T在血液腫瘤治療方面還有許多其他抗原，其中BCMA、CD22、CD20較為常見(jiàn)。

      在實(shí)體瘤治療方面，以間皮素（Mesothelin）為靶點(diǎn)的CAR-T臨床試驗數量暫時(shí)處于領(lǐng)先地位。作為一個(gè)潛在的良好靶點(diǎn)，間皮素在實(shí)體瘤細胞中大量表達，但在正常組織中的表達水平卻很低。實(shí)驗數據顯示，間皮素在間皮瘤、胰 腺癌和肺癌細胞表面均有表達。緊隨其后，針對磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）靶點(diǎn)治療肝癌、雙唾液酸神經(jīng)節苷脂2（GD2）靶點(diǎn)治療神經(jīng)母細胞瘤以及針對CEA靶點(diǎn)治療腸癌的CAR-T療法也受到了廣泛關(guān)注。

      二、CAR-T結構中抗體scFv的篩選

      CAR是以抗體的scFv（單鏈可變區）識別腫瘤抗原的。因此，與單抗的研發(fā)路徑類(lèi)似，CAR-T的研發(fā)也需要獲取和篩選單抗。雜交瘤技術(shù)是獲取單抗的基礎，該技術(shù)可獲得相應的分泌單抗的雜交瘤細胞。篩選出親和力高的單抗后，將相應的雜交瘤細胞凍存傳代形成穩定的細胞株，用于CAR結構中scFv序列的構建。

      scFv由重鏈、輕鏈以及之間的linker連接而成，所以將不同的重鏈和輕鏈隨機組合，可以建成人源化的scFv組合抗體文庫，再通過(guò)表達量、穩定性、與抗原的親和力等指標進(jìn)行篩選。如果收集攜帶特定腫瘤抗原的患者外周血B淋巴細胞（比如30-100例），通過(guò)提取其中的mRNA并反轉錄獲得cDNA，也可以作為全人源抗體庫的素材。

      高通量篩選主要通過(guò)噬菌體展示技術(shù)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，噬菌體展示技術(shù)是將外源的抗體基因與噬菌體衣殼蛋白基因融合，以融合蛋白的形式呈現在噬菌體的表面。這個(gè)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是直接將表達出來(lái)的抗體與其基因型聯(lián)系在一起，再利用抗原—抗體的特異性結合，將感興趣的抗體挑選出來(lái)。通過(guò)噬菌體技術(shù)，可高效的獲得scFv人源化片段，提高CAR-T的安全性和有效性。

      scFv序列是CAR-T研發(fā)中的核心技術(shù)，從華創(chuàng )證券的調研信息來(lái)看，篩選一個(gè)合適的scFv序列時(shí)間成本和費用成本都不低，鼠源性的成本在幾十萬(wàn)元，人源化的則需要上百萬(wàn)元。目前很多科研機構使用的序列是從文獻上獲取的，原則上只能用于科研。所以如果是要做創(chuàng )新型CAR-T，進(jìn)行商業(yè)化，則需要科研機構或企業(yè)自主研發(fā)篩選。

      三、CAR-T的轉染載體與制備工藝

      為實(shí)現CAR在T細胞上的表達，需要通過(guò)載體將CAR基因導入T細胞。理想的載體應該具有較高的基因轉染效率，穩定性好，不引起機體免疫反應等特點(diǎn)。目前有多種載體用于CAR-T細胞產(chǎn)品制備，包括病毒載體轉導（如γ-逆轉錄病毒載體或慢病毒載體）及非病毒載體轉染（如轉座子轉染、mRNA電穿孔轉染等）等，雖然已開(kāi)展的臨床試驗中以病毒載體轉導的方式為主，但以非病毒載體轉染的方式也在不斷得到青睞。

      逆轉錄病毒是一種RNA病毒，只能轉染分裂期細胞，目的基因可以長(cháng)期表達，技術(shù)上較為容易，已具有20多年的臨床安全性研究歷史。慢病毒是以HIV病毒為基礎發(fā)展起來(lái)的載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，轉染效率高，插入誘變可能性小，是目前應用最多的載體系統。病毒基因轉移載體的主要優(yōu)點(diǎn)是制造、生產(chǎn)相對容易以及能夠將遺傳物質(zhì)穩定整合到宿主基因組中。然而，病毒載體的致病性和潛在的插入誘變可能性在人類(lèi)臨床試驗中存在顯著(zhù)的監管障礙，非病毒載體的開(kāi)發(fā)顯得十分重要。轉座子和mRNA電穿孔技術(shù)是目前研究比較多的兩類(lèi)非病毒載體系統。

      相較于病毒載體，轉座子能呈遞更大的負荷，成本效益高，免疫原性低?；谵D座子的載體系統主要有兩種類(lèi)型：睡美人（Sleeping Beauty，SB）系統和PiggyBac系統。轉座子最終可能發(fā)展成多功能T細胞基因轉移系統，但目前的DNA電穿孔方法通常產(chǎn)生較差的細胞活力，臨床應用中需要擴大T細胞培養以產(chǎn)生大量 T 細胞。

      目前，mRNA電穿孔被認為是最安全的T細胞基因轉導方法，其可轉導靜止或增殖緩慢的T細胞，轉導效率多在90%以上，且設計相對容易，性?xún)r(jià)比高。臨床上已經(jīng)使用利用瞬時(shí)mRNA轉染產(chǎn)生的CAR-T細胞，然而，這種方法需要幾輪CAR-T細胞輸注。在臨床前模型中，mRNA電穿孔轉導的靶向間皮素的CAR-T能引起播散性間皮瘤異種移植物的消退，然而，在灌輸49天后一名患者出現了過(guò)敏性反應。

      CAR-T細胞的制備需要一些小心操作的步驟，而且整個(gè)過(guò)程中都需進(jìn)行質(zhì)量監控測試。CAR-T的GMP制備工藝主要包括如下過(guò)程：T細胞收集和分離，T細胞激活和修飾，T細胞擴增，T細胞收獲與回輸。生產(chǎn)過(guò)程通常需要5-10天，從收集到回輸需要2-4周（根據病人的臨床狀態(tài)和化療預處理方案確定）。

      四、展望

      CAR-T細胞制造是一個(gè)非常復雜的過(guò)程，制造難、成本高已經(jīng)成為了行業(yè)發(fā)展的瓶頸問(wèn)題。目前，吉利德和諾華公司均采用的是集中生產(chǎn)模式，首先在醫院中提取患者的T細胞，然后將這些細胞運送至制造中心，在制造中心對T細胞進(jìn)行基因工程設計，最后將設計后的T細胞運回醫院回輸至患者體內。然而，無(wú)論使用何種制造模式，成功的CAR-T細胞制造都依賴(lài)于端到端流程的優(yōu)化能力，包括工作流程的簡(jiǎn)化、產(chǎn)能規劃以及生產(chǎn)的可擴展性等等。傳統的制造工藝以及傳統設備已經(jīng)不能滿(mǎn)足行業(yè)發(fā)展需求，自動(dòng)化、全封閉的新一代制造工藝是未來(lái)趨勢。隨著(zhù)CAR-T制造工業(yè)的發(fā)展，目前市場(chǎng)上已經(jīng)有一些解決方案供CAR-T開(kāi)發(fā)商選擇，例如博雅控股集團旗下的CAR-TXpress？、美天旎的CliniMACS Prodigy？以及GE公司的FlexFactory？等，這些平臺受到了整個(gè)行業(yè)的關(guān)注，業(yè)內人士也對它們充滿(mǎn)了期待。

      自動(dòng)化、全封閉的CAR-T制造工藝是規?；a(chǎn)以及降低制造成本的有效途徑。隨著(zhù)CAR-T療法獲批上市，市場(chǎng)對新一代制造工藝的需求日益劇增。目前，CAR-T制造創(chuàng )新專(zhuān)利陸續問(wèn)世，CAR-T細胞合同定制開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)制造（CDMO）的服務(wù)模式也開(kāi)始進(jìn)入國內外市場(chǎng)，CAR-T療法迎來(lái)了全新發(fā)展階段，有望造福更多患者。