PART

       0 1.

       什么是脂質(zhì)體？

       1961年，Alec Douglas. Bangham和R.W.Horne用經(jīng)過(guò)負染的磷脂調試電子顯微鏡時(shí)，在電鏡下觀(guān)察到磷脂形成了類(lèi)似細胞質(zhì)膜的結構，并于1964年發(fā)表了他們拍攝的電鏡照片。進(jìn)一步研究發(fā)現，當磷脂分散在水中時(shí)會(huì )形成多層小囊泡，并且每一層均為脂質(zhì)雙分子層，各層之間被水相隔開(kāi)。他們將這種內部是一定量水完全由單層或多層同心（或非同心）磷脂雙分子層包裹的人工囊泡稱(chēng)為脂質(zhì)體。由于脂質(zhì)體的結構類(lèi)似于生物膜，故又稱(chēng)為人工生物膜。

       脂質(zhì)體的基本結構和類(lèi)型可分為單層脂質(zhì)體和多層脂質(zhì)體。含有單層雙分子層磷脂膜的囊泡成為單層脂質(zhì)體（ULV）即單室脂質(zhì)體。單室脂質(zhì)體又分為小單室脂質(zhì)體（SUV, 粒徑＜100nm）即納米脂質(zhì)體、大單室脂質(zhì)體（LUV, 粒徑＞100nm）和巨大大單室脂質(zhì)體（GUV, 粒徑＞1000nm）。含有多層雙分子層磷脂膜的囊泡稱(chēng)為多層脂質(zhì)體（MLV, 粒徑100~1000nm）。含有多個(gè)單室脂質(zhì)體的囊泡稱(chēng)為多室脂質(zhì)體（MVV, 粒徑＞1000nm）。

       PART

       0 2.

       什么是脂質(zhì)體包封率？

       包封率是脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性，它指的是包封在脂質(zhì)雙分子層中的藥物含量占總投藥量的百分比，能反映出脂質(zhì)體中藥物包封程度的高低，以指導制備工藝的改進(jìn)。

       由于包封的藥物性質(zhì)不同，脂質(zhì)體膜材料不同，測定每種脂質(zhì)體包封率的最 佳方法往往需要經(jīng)實(shí)驗考察才能確定。包封率測定的關(guān)鍵是將包封藥物和未包封的游離藥物分離，再利用光譜、色譜等分析手段檢測包封藥物或游離藥物的濃度。常用的包封率測定方法有：離心法、超濾離心法、葡聚糖凝膠柱法、微柱離心法、透析與反透析法、魚(yú)精蛋白凝聚法、熒光法等。

       （一） 離心法

       按照離心轉速的不同，離心法分為低速離心法和超速離心法。低速離心法適用于脂溶性藥物，其工作原理是脂溶性的游離藥物不溶于溶解脂質(zhì)體所需的水相介質(zhì)，而懸浮在體系中，采用相 對較小的離心強度和較短的離心時(shí)間，這些未溶的游離藥物會(huì )因離心力的作用而沉降，但脂質(zhì)體仍存在于上清液中，從而實(shí)現分離。

       超速離心法要求離心轉速大于20 000 r／min，離心時(shí)間一般要長(cháng)于30 min。離心過(guò)程中因空氣摩擦產(chǎn)熱，需使用控溫離心機。與低速離心法剛好相反，超速離心法中脂質(zhì)體最終存在于沉淀中。由于脂質(zhì)體和不溶的游離藥物會(huì )一起沉降下來(lái)，無(wú)法實(shí)現二者的分離，所以此法適用于水溶性較好的藥物的測定，可保證游離藥物仍存在于上清液中。此外應注意較強的離心力作用可能會(huì )導致微粒聚集，破壞脂質(zhì)體雙分子層結構，導致藥物發(fā)生泄漏。

       （二） 超濾離心法

       超濾離心法是將脂質(zhì)體放入配有超濾膜的超濾管中，在適宜的轉速下離心，游離藥物在離心力的作用下可通過(guò)超濾膜，而脂質(zhì)體則被截留，從而實(shí)現二者的分離。超濾離心法多用于測定水溶性藥物脂質(zhì)體的包封率。

       然而“濃差極化”現象的存在限制了超濾法的應用。濃差極化現象是由于在超濾過(guò)程中，溶劑和小分子溶質(zhì)能透過(guò)超濾膜，而大分子溶質(zhì)被截留在膜內，這就會(huì )導致超濾膜表面的大分子溶質(zhì)濃度升高，引起膜附近的滲透壓增加，阻礙溶液繼續向超濾膜方向擴散，進(jìn)而降低了溶劑和小分子物質(zhì)的膜透過(guò)率。

       （三） 葡聚糖凝膠柱法

       葡聚糖顆粒在溶脹后可形成凝膠狀結構，其內部具有一定大小的孔徑，小分子游離藥物可進(jìn)入孔內，實(shí)現一定程度的保留；而脂質(zhì)體粒徑大于凝膠孔徑，脂質(zhì)體無(wú)法進(jìn)入孔內，于是少量洗脫液便可將其洗脫下來(lái)。利用脂質(zhì)體和游離藥物在葡聚糖凝膠柱上保留能力的不同可實(shí)現二者的分離。

       （四） 微柱離心法

       相比葡聚糖凝膠柱法，微柱離心法加入的洗脫液體積大大減小，避免了脂質(zhì)體因稀釋作用而發(fā)生的泄漏。此法是將溶脹好的葡聚糖凝膠或經(jīng)預處理的離子交換樹(shù)脂裝入注射器中，反復平衡、離心后制成干燥的微柱，然后在其頂端加入脂質(zhì)體混懸液，靜置幾分鐘后再加入洗脫液，設置適宜的離心轉速將脂質(zhì)體洗脫下來(lái)。若凝膠對脂質(zhì)體有很強的吸附作用，則不能選用該法。實(shí)驗中應注意離心轉速的選擇，轉速過(guò)大或過(guò)小都可能引起凝膠柱柱頭斷裂，且轉速過(guò)大會(huì )將游離藥物也洗脫下來(lái)。

       （五） 透析與反透析法

       透析法是將脂質(zhì)體放入截留一定分子量的透析袋內，一般用水或PBS緩沖液作為透析介質(zhì)，游離藥物因透析袋內外的濃度差而向透析介質(zhì)中轉移，而脂質(zhì)體因為粒徑較大則被截留在透析袋內，二者因此實(shí)現分離。但脂溶性游離藥物在透析介質(zhì)中溶解度較差，會(huì )聚集在透析膜表面，堵塞膜上微孔而無(wú)法進(jìn)入透析外液。

       透析試驗中為了滿(mǎn)足漏槽條件，需要大量的透析介質(zhì)，這無(wú)疑會(huì )稀釋整個(gè)脂質(zhì)體系統，破壞脂質(zhì)體和周?chē)坞x藥物的動(dòng)態(tài)平衡，甚至導致脂質(zhì)體的泄漏，并且較長(cháng)的透析時(shí)間也對脂質(zhì)體的穩定性有很高的要求。反透析法可以避免上述問(wèn)題的發(fā)生。它是將脂質(zhì)體放在透析袋外，透析袋內裝入透析介質(zhì)。由于透析介質(zhì)用量大大減少，可有效避免脂質(zhì)體因為稀釋作用而發(fā)生的泄漏。

       （六） 其他方法

       魚(yú)精蛋白凝聚法：魚(yú)精蛋白是一種堿性蛋白質(zhì)，帶正電，它可與帶負電或中性的脂質(zhì)體結合形成聚合物，密度有所增加，離心后脂質(zhì)體-魚(yú)精蛋白聚合物被沉淀下來(lái)，因而與游離藥物實(shí)現分離。

       固相萃取法：利用色譜吸附原理，游離藥物被吸附在極性相近的SPE柱固定相上，而脂質(zhì)體在SPE 柱上無(wú)保留，少量水便可洗脫下來(lái)。固相萃取法對脂質(zhì)體和游離藥物的分離度較高，因為它是借助更特征的，更穩定的吸附能力的差異實(shí)現分離。然而該法較為復雜，藥物與SPE柱固定相之間吸附作用的強弱受多種因素影響，需要進(jìn)行大量實(shí)驗才能摸索出最 佳的實(shí)驗條件。

       熒光法：目前使用的包封率測定方法大部分都需要先將脂質(zhì)體和游離藥物分離，而熒光法不需進(jìn)行分離，只要利用包封藥物和游離藥物不同的熒光特性，比較脂質(zhì)體破乳前后熒光強度的變化，便可計算出包封率。

       表1 幾種載藥脂質(zhì)體包封率測定方法對比

       備注：EPC:蛋黃卵磷脂;CHOL:膽固醇;DPPC:二棕櫚酰磷脂酰膽堿;DCP:鞘髓磷脂;GMS:單雙甘油脂肪酸酯;SPC:大豆卵磷脂;DDAB:雙十二烷基二甲基溴化銨;PEG2000:聚乙二醇2000;DSPE-PEG2000:二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000;PC:卵磷脂; DSPE-PEG2000-NHS:二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000-N-羥基琥珀酰亞胺;DOTAP:(2,3-二油?；?丙基)-三甲胺;HSPC:氫化大豆卵磷脂;DOPE:二油酰磷脂酰乙醇胺

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       0 3.

       如何選用最合適的包封率測定方法呢？

       低速離心法適用于脂溶性藥物，操作簡(jiǎn)單，且不易破壞脂質(zhì)體膜結構，但脂質(zhì)體和游離藥物常常不能完全分離；超速離心法多用于水溶性藥物，且要求脂質(zhì)體膜結構有一定的硬度，能夠耐受高轉速的影響。超濾離心法適用范圍較廣，超濾膜的材料和截留分子量有多種類(lèi)型，可滿(mǎn)足試驗者的多重需要；其缺點(diǎn)是可能會(huì )出現濃差極化現象，在一定程度上稀釋脂質(zhì)體待測溶液可以避免該現象的發(fā)生。葡聚糖凝膠柱法和微柱離心法均是利用分子排阻的原理來(lái)分離，但如果藥物在凝膠柱上無(wú)保留或吸附過(guò)強，則不能采用這兩種方法。葡聚糖凝膠柱法由于大量洗脫液的加入稀釋了脂質(zhì)體系統，可能會(huì )導致脂質(zhì)體泄漏。但是微柱離心法的柱體積小，加入洗脫液的體積也少，不會(huì )引起脂質(zhì)體泄漏，但是需要考察離心轉速，以獲得最 佳的分離效果。透析法也是測定包封率的常用手段，適用于水溶性藥物，但是透析時(shí)間一般長(cháng)達36 h以上，對脂質(zhì)體穩定性有較高要求；此外大量透析介質(zhì)的加入同樣會(huì )稀釋脂質(zhì)體系統，也可能導致脂質(zhì)體泄漏。反透析法極大地減少了透析介質(zhì)的用量，較好地避免了因稀釋作用而發(fā)生的脂質(zhì)體泄漏。魚(yú)精蛋白凝聚法只適用于帶負電及中性的脂質(zhì)體，而固相萃取法雖然在分離脂質(zhì)體和游離藥物方面有不錯的效果，但是實(shí)驗方法復雜，不易摸索出最 佳分離條件。熒光法可在脂質(zhì)體和游離藥物共存的狀態(tài)下測定包封率，不要求把二者分離，但一般均需要引入熒光指示劑，發(fā)生某種熒光反應來(lái)計算包封率。

       根據待測物的性質(zhì)和各種測定方法的特點(diǎn)，總結出脂質(zhì)體包封率測定方法選擇決策樹(shù)，見(jiàn)圖1。

       圖1 脂質(zhì)體包封率測定方法選擇決策樹(shù)

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       0 4.

       影響脂質(zhì)體包封率的因素有哪些？

       影響脂質(zhì)體包封率的因素有很多，包括脂質(zhì)膜的組成、磷脂鏈長(cháng)、電荷、粒徑大小、制備方法、藥物的性質(zhì)等，選擇其中合適的一項或者幾項進(jìn)行改進(jìn)，能改善或提高脂質(zhì)體的包封率。

       脂質(zhì)膜組成和脂質(zhì)體電位

       脂質(zhì)雙層膜的組成影響著(zhù)藥物在膜內的分配和包封率。脂質(zhì)體由大豆或蛋黃中提取的磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）或其氫化衍生物制備而成。天然磷脂上含有不飽和脂肪酰鏈，而它們易氧化分解，影響脂質(zhì)體的穩定性。

       藥物性質(zhì)

       藥物自身的溶解度、極性和雙分子層的匹配程度等因素均會(huì )對包封率產(chǎn)生影響。具有高親脂性或高親水性的藥物，即lgPoct 在4.5~-0.3 的藥物能形成包封率較高的脂質(zhì)體。所以可以考慮將藥物成鹽或者酯化再形成脂質(zhì)體，以提高脂質(zhì)體的包封率或穩定性。

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       0 5.

       包封率如何計算？

       《中國藥典》2005年版（二部）附錄“微囊、微球及脂質(zhì)體制劑指導原則”中質(zhì)量檢查項目下規定：若得到的是分散在液體介質(zhì)中的微囊、微球、脂質(zhì)體，應通過(guò)適當的方法（如凝膠色譜柱法、離心法或透析法）進(jìn)行分離后測定，按下式計算包封率。

       包封率（%）=系統中包封的藥量/系統中包封與未包封的總藥量×100%

       包封率不得小于80%。

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       0 6.

       展望

       現有的包封率測定方法基本上都是利用脂質(zhì)體和游離藥物在粒徑尺寸方面的差異先將二者分離，再準確測定某一方的濃度。但是這種物理差異專(zhuān)屬性不強且不穩定，易受影響和干擾。未來(lái)包封率測定方法應該更多地結合光譜、色譜等手段，以增加方法的專(zhuān)屬性和可靠性，還可利用脂質(zhì)體和游離藥物在物理、化學(xué)性質(zhì)方面其他的不同點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出具有不同工作原理的新方法，并且各種方法之間可以相互印證，使測定結果更可靠。