藥物發(fā)現既昂貴又耗時(shí)。盡管在研發(fā)方面投入了大量資金，但自20世紀90年代以來(lái)，美國食品和藥物管理局（FDA）批準的平均藥物數量一直在下降。目前，每個(gè)被批準的新分子實(shí)體的研發(fā)成本約為18億美元，再加上專(zhuān)利到期，使制藥公司面臨著(zhù)艱巨的任務(wù)——開(kāi)發(fā)更多的產(chǎn)品以維持其創(chuàng )新。此外，藥物發(fā)現失敗率的升高會(huì )降低對衍生化合物、微小配方變化或藥物組合的原創(chuàng )研究熱情。

       決定藥物發(fā)現成功的重要因素之一是體內藥物動(dòng)力學(xué)。這是指藥物與其靶點(diǎn)的結合動(dòng)力學(xué)，包括結合和解離時(shí)間，這會(huì )影響藥物在體內的停留時(shí)間。隨著(zhù)制藥公司更多地關(guān)注于優(yōu)化靶點(diǎn)結合親和力和選擇性，藥物動(dòng)力學(xué)往往不被重視，盡管越來(lái)越多的證據表明動(dòng)力學(xué)參數與藥物療效的相關(guān)性可能比親和力參數更強。在此，本文將討論用于研究藥物動(dòng)力學(xué)的實(shí)驗和建模方法，以及如何利用它們來(lái)提高藥物發(fā)現的成功率。

       01 動(dòng)力學(xué)的重要性

       藥物發(fā)現通常是通過(guò)在恒定藥物濃度下通過(guò)一系列體外實(shí)驗來(lái)識別和優(yōu)化先導化合物。這些實(shí)驗產(chǎn)生均衡量化指標，包括半數抑制濃度（IC50）和平衡解離常數（KD），用于預測藥物活性。

       然而，當藥物進(jìn)入人體時(shí)，由于胃腸道吸收、腎 臟排泄和代謝等生理過(guò)程，它們的濃度會(huì )不斷變化。因此，越來(lái)越多的人認識到，基于均衡（equilibrium）的模型來(lái)評估藥物-靶點(diǎn)相互作用，對體內藥理學(xué)的預測性較差，而能夠捕捉藥物動(dòng)力學(xué)的模型更適用于描述體內非均衡情況下的動(dòng)態(tài)藥物-靶點(diǎn)相互作用。

       02 結合及解離速率

       表征動(dòng)態(tài)藥物相互作用的2個(gè)最基本的單位是結合速率常數（association rate constant/on-rate，kon）和解離速率常數（dissociation rate constant/off-rate，koff）。當一起使用時(shí)，這些參數可以洞察藥物-靶點(diǎn)復合物的分子識別和穩定性。研究表明，藥物停留時(shí)間（RT=1/koff是藥物療效和選擇性的關(guān)鍵預測因子，因為停留時(shí)間較長(cháng)的藥物能夠通過(guò)減少靶點(diǎn)占有率的下降而產(chǎn)生更持久的作用，靶點(diǎn)占有率用于描述配體分子對靶點(diǎn)占據的程度。

       雖然關(guān)于koff和如何減少koff的研究已經(jīng)很多，但關(guān)于koff及其對體內靶點(diǎn)占有率的影響的數據相對較少。有趣的是，Zhou與其同事們（doi:10.1002/psp4.12035）發(fā)現，與流行的觀(guān)念相反，增加kon可以延長(cháng)靶點(diǎn)占有時(shí)間。這一發(fā)現表明了優(yōu)化kon和koff的重要性。

       IJzerman和Guo認為，對kon的研究不那么重視的一個(gè)原因是對度量的普遍假設存在疑問(wèn)。20世紀90年代初，Smoluchowski開(kāi)發(fā)了一種數學(xué)方法來(lái)建模生物分子反應，例如受體和配體之間的分子反應。該模型適用于各向同性、非相互作用的球體，其中kon僅取決于分子的大小及其溶劑的粘度，即擴散受限。然而，當涉及到具有立體特異性的藥物-靶點(diǎn)相互作用的建模時(shí)，假設kon不變且擴散受限就不再有用了。例如，如果一個(gè)配體只能在特定的位置和方向上與其受體結合，kon就會(huì )顯著(zhù)下降。另一方面，有利的靜電吸引可以顯著(zhù)增加kon。

       03 實(shí)驗工具

       據了解，有多種技術(shù)可以測量kon和koff，最古老的方法之一是放射配體結合分析法，但它存在一些局限性，例如難以將**標記配體與游離配體分離。這種分析法也忽略了由于配體結合而在受體中可能發(fā)生的構象變化，G蛋白偶聯(lián)受體就是這樣一個(gè)例子。

       一種流行的、無(wú)標記的方法是表面等離子體共振（SPR），其中藥物-靶點(diǎn)復合物的形成會(huì )導致偏振光的折射率變化。它的優(yōu)點(diǎn)是試劑和樣品消耗量低，不需要標記，可以實(shí)時(shí)提供數據。SPR可用于測量各種分子之間的生物分子相互作用，包括蛋白質(zhì)、離子和片段。然而，由于配體是分批測量的，通量仍然很低。此外，研究膜結合蛋白可能是一個(gè)挑戰，因為偏離天然構象的蛋白質(zhì)可能與其靶點(diǎn)具有不同的相互作用。此外，蛋白質(zhì)需要穩定地結合到等離子體芯片上，這可能會(huì )限制這種方法的適用性。

       可以說(shuō)，目前使用最廣泛的技術(shù)是熒光共振能量轉移（FRET）和生物發(fā)光共振能量轉移（BRET），因為它們具有高靈敏度、與活細胞狀態(tài)的相容性，并且能夠通過(guò)商業(yè)設計熒光探針用于多種蛋白質(zhì)。

       這2種方法的機理相似，依賴(lài)于能量從供體分子到受體分子的距離依賴(lài)性轉移。為了使FRET和BRET能夠很好地工作，供體和受體分子必須非常接近（分別為10–100Å和10nm）。在FRET中，分子之間也必須有光譜重疊。與FRET不同，BRET不需要外部光源來(lái)激發(fā)供體分子。因此，它具有非常低的干擾背景信號，例如與FRET相關(guān)的自發(fā)熒光、光散射和光漂白。

       其他新興的方法包括石英晶體微天平，它可以檢測由于配體與細胞結合而引起的質(zhì)量變化，以及熒光相關(guān)光譜術(shù)，它可以測量粒子熒光強度的波動(dòng)，其中自由配體可以與緩慢擴散的受體結合配體區分開(kāi)來(lái)，而無(wú)需物理分離。等溫滴定量熱法（ICT）可實(shí)時(shí)測量生化反應引起的熱變化，并可直接讀出酶活性對抑制劑結合的響應。例如，熱信號的變化速率與抑制劑與酶的結合速率相關(guān)，這使我們能夠計算結合速率常數。雖然ICT在藥物動(dòng)力學(xué)方面的應用受到限制（大部分應用是在熱力學(xué)方面），但該技術(shù)已被用于確定共價(jià)和非共價(jià)抑制劑與脯氨酰寡肽酶（POP）的結合動(dòng)力學(xué)參數，后者是治療癌癥和神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)有希望的靶點(diǎn)。

       對藥物動(dòng)力學(xué)的日益重視導致了由歐洲創(chuàng )新藥物計劃（Innovative Medicines Initiative，IMI）與大型制藥公司共同資助的K4DD（Kinetics for Drug Discovery，藥物發(fā)現動(dòng)力學(xué)）項目的誕生。該項目的一個(gè)主要發(fā)現是結合和解離速率常數受配體結構的強烈影響。讀者可以參考ChEMBl數據庫（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）了解生物活性化合物的結構=動(dòng)力學(xué)關(guān)系。

       04 計算建模工具

       隨著(zhù)X射線(xiàn)晶體學(xué)和電子顯微鏡的進(jìn)步，對藥物-靶點(diǎn)相互作用動(dòng)力學(xué)的分子理解有所提高。利用所得數據，研究人員開(kāi)發(fā)了計算模型，以了解定量結構動(dòng)力學(xué)關(guān)系（QSKR）。這些模型通常使用統計機器學(xué)習來(lái)獲得藥物-靶點(diǎn)復合物的結構信息或者使用增強采樣的分子動(dòng)力學(xué)模擬來(lái)建立。研究人員還將人工智能與分子模擬相結合，例如，Ribeiro等人利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )從無(wú)偏分子動(dòng)力學(xué)中學(xué)習，然后創(chuàng )建了一個(gè)新框架來(lái)研究苯與溶菌酶的解離，這是一種十分受歡迎的常被研究的配體-蛋白質(zhì)復合物。

       例如，苯的離解會(huì )在溶菌酶中形成一個(gè)空腔，從而影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)，如變性溫度和與特定配體的結合。這為優(yōu)化蛋白質(zhì)工程創(chuàng )造了機會(huì )。Decherchi和Cavalli寫(xiě)了一篇綜述，總結了分子模擬和取樣方法的進(jìn)展。在他們的工作中，他們解釋稱(chēng)，由于配體-蛋白質(zhì)結合和解除結合的時(shí)間尺度范圍很廣，因此分子模擬捕捉大分子的實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)仍然具有挑戰性?？紤]到分子模擬中的時(shí)間步長(cháng)為1飛秒，為了驗證毫秒或秒級的采樣事件，需要1012或1015個(gè)整合步驟，這超出了當前可用的計算技術(shù)。然后，作者總結了分子模擬對藥物動(dòng)力學(xué)的貢獻，例如根據配體的藥物停留時(shí)間對其進(jìn)行排序。

       05 展望未來(lái)

       人體是不斷變化的，因此捕捉動(dòng)態(tài)藥物動(dòng)力學(xué)是一項挑戰。這是復雜的，因為還有其他因素影響藥物動(dòng)力學(xué)。例如，動(dòng)力學(xué)選擇性，它指的是藥物結合選定靶點(diǎn)（chosen target）而非結合脫靶（off-target）的相對能力。該參數提供了對不想要的不利影響的洞察。動(dòng)力學(xué)選擇性反過(guò)來(lái)又受到熱力學(xué)性質(zhì)的影響，例如吉布斯能（Gibbs energy）和結合焓（enthalpy of binding），它們提供了驅動(dòng)藥物-靶點(diǎn)相互作用的分子間作用力的根本信息。

       進(jìn)一步證實(shí)其重要性的是，動(dòng)力學(xué)選擇性反過(guò)來(lái)會(huì )影響靶點(diǎn)易受攻擊性（target vulnerability），其定義為必須參與結合以引發(fā)所需響應的靶點(diǎn)比例。與高易受攻擊性靶點(diǎn)相比，低易受攻擊性靶點(diǎn)需要相對較高的藥物暴露水平，才能達到藥理學(xué)相關(guān)的靶點(diǎn)參與水平。這意味著(zhù)，高易受攻擊性靶點(diǎn)受到動(dòng)力學(xué)選擇性的強烈影響，因為產(chǎn)生一小部分活性靶點(diǎn)（例如靶點(diǎn)參與結合后通過(guò)藥物離解）需要更多時(shí)間。

       雖然預測藥物動(dòng)力學(xué)是復雜的，但隨著(zhù)實(shí)驗和建模方法的不斷改進(jìn)，有望做出更好的預測來(lái)提高藥物的療效和安全性。

       參考資料：Andy Tay, PhD：Assessing Kinetics in Drug Discovery