嵌合抗原受體T細胞（(CAR-T）療法在血液系統惡性腫瘤的治療中取得了一定的突破，但是同期PD-1產(chǎn)品，僅Keytruda在2021年就實(shí)現170多億美元的營(yíng)收，但是與此相比所有上市的CAR-T產(chǎn)品2021年總營(yíng)收也難望其項背。原因很多（治療費用高昂、產(chǎn)能不足等），其中重要的一個(gè)因素是適應癥局限于血液瘤，且大部分都是末線(xiàn)治療。所有針對實(shí)體瘤的CAR-T還處于探索階段，目前CAR-T治療在實(shí)體瘤中面臨著(zhù)很多挑戰，包括免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）、腫瘤抗原異質(zhì)性、基質(zhì)障礙和腫瘤可及性，以及靶向/脫靶等困境。

       A 抑制性腫瘤微環(huán)境

       與血液系統惡性腫瘤不同，實(shí)體瘤中癌細胞的可及性受到限制，其中還包括一些物理障礙，比如腫瘤脈管系統和細胞外基質(zhì)，這些會(huì )阻礙注入的CAR-T細胞滲透到腫瘤組織。實(shí)體瘤是一種器官樣、雜亂無(wú)章的結構，由增殖的腫瘤細胞組成，周?chē)兄С中曰|(zhì)細胞和滋養腫瘤新血管系統的血管，腫瘤的生長(cháng)可以由先天性和適應性成分控制。實(shí)體瘤中先天免疫細胞主要有：中性粒細胞、巨噬細胞、樹(shù)突細胞（DC）、肥大細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）和髓源性抑制細胞（MDSC）。適應性免疫細胞：T和B細胞以及調節性T細胞（Tregs）。所有這些免疫細胞都與構成TME的非腫瘤基質(zhì)細胞相關(guān)：內皮細胞、成纖維細胞、周細胞和間充質(zhì)細胞。上述這些細胞及其分泌的因子和分子構成了TME。CAR-T細胞在實(shí)體惡性腫瘤治療中遇到的主要障礙，是TME通過(guò)抑制性可溶性因子和過(guò)度表達陰性免疫檢查點(diǎn)來(lái)阻止T淋巴細胞向腫瘤運輸和滲透建立免疫抑制環(huán)境，T細胞有效浸潤到腫瘤基質(zhì)中是保持被注入T細胞的抗腫瘤活性和癌癥免疫治療成功的關(guān)鍵步驟。

       圖1 腫瘤免疫抑制微環(huán)境

       ?腫瘤微環(huán)境缺氧

       （1）缺氧是影響腫瘤進(jìn)展并改變癌癥患者治療結果的腫瘤微環(huán)境的標志。缺氧誘導因子（HIF）的穩定性和核轉位，它通過(guò)與缺氧誘導基因啟動(dòng)子中的缺氧反應元件（HRE）區域結合來(lái)進(jìn)一步調節基因轉錄，導致細胞適應環(huán)境變化。另一方面，感染和炎癥過(guò)程中產(chǎn)生的T細胞受體（TCR）激活信號或細胞因子可以調節HIF的合成和穩定性，進(jìn)而影響T淋巴細胞的激活和分化。在持續感染或腫瘤微環(huán)境下，TCR介導的T細胞刺激和缺氧條件增加了HIF豐度和細胞**T淋巴細胞（CTL）的效應功能。這時(shí)，Von Hippel-Lindau （VHL）因子會(huì )部分抑制T細胞反應，以保護身體免受過(guò)度反應的破壞性。T淋巴細胞中HIF1α的穩定與糖酵解酶（如作為葡萄糖轉運蛋白的GLUT-1）表達的增強和氧化磷酸化速率的降低平行，因此可以通過(guò)缺氧依賴(lài)和缺氧非依賴(lài)途徑增加HIF水平和活性，作為代謝途徑的調節劑，并參與T細胞增殖、分化和效應活性。

       （2）缺氧會(huì )促進(jìn)三磷酸腺苷（ATP）分解和抑制腺苷激酶（將腺苷磷酸化位AMP），從而導致腺苷增強。腫瘤微環(huán)境中低氧來(lái)源積累的腺苷與T細胞表達的特定受體（即A2AR和A2BR）的相互作用會(huì )干擾TCR信號傳導，從而抑制T細胞的抗腫瘤活性。重要的是，腺苷和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的相互作用激活蛋白酶A（PKA），后者隨后調節TCR下游信號傳導。如果CAR-T細胞表達RIAD（調節亞基I錨定破壞肽）能阻止PKA在免疫突觸中的定位，可以削弱腺苷對間皮素-CAR-T細胞活性的抑制作用；另外使用小分子如BAY 60–6583（腺苷A2B受體激動(dòng)劑）可以通過(guò)影響多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)提高CAR-T細胞的治療效果。

       （3）免疫檢查點(diǎn)PDL1分子以HIF-1α依賴(lài)方式上調，缺氧的環(huán)境阻礙了浸潤T細胞的功能。通過(guò)PD1阻斷消除PD1與PDL1的相互作用可以增強腫瘤浸潤T淋巴細胞上A2AR的表達，導致對積累的腺苷免疫抑制的敏感性增強。因此同時(shí)靶向PD1/PDL1軸和腺苷A2A（通過(guò)遺傳或藥理學(xué)方法），可以改善CAR-T細胞治療中的T細胞性能。

       B 限制進(jìn)入腫瘤細胞

       ?細胞外基質(zhì)

       細胞外基質(zhì)（ECM）作為腫瘤周?chē)|(zhì)的一部分，由纖維蛋白、糖蛋白、多糖和蛋白聚糖組成。惡性組織中ECM成分的表達和密度增加，特別是透明質(zhì)酸和膠原蛋白的過(guò)度產(chǎn)生和沉積，阻礙了治療劑的滲透。此外膠原蛋白密度升高會(huì )損害T細胞的增殖和細胞毒活性，并誘導調節表型，而且CAR-T細胞制造的策略也可能造成ECM降解酶表達下調。鑒于這些事實(shí)，應用ECM降解酶（如透明質(zhì)酸酶和膠原酶）可以降低ECM硬度并促進(jìn)抗癌劑的輸送。Caruana及其同時(shí)在CAR修飾的T細胞中誘導乙酰肝素酶 (HPSE) 表達，從而提高了共表達 CAR T細胞（即表達的CAR和HPSE）ECM降解能力和抗腫瘤活性。

       ?腫瘤血管

       癌細胞的細胞分裂不受控制，需要形成新的血管來(lái)獲取營(yíng)養和氧氣。異常脈管系統的發(fā)展，以及參與T細胞外滲的黏附分子的下調（在bFGF和VEGF等血管生成因子的影響下），成為T(mén)細胞滲透到腫瘤床的物理屏障。此外，腫瘤微環(huán)境中的內皮細胞促進(jìn)FasL和抑制性分子（如PD-L1、TIM3、IDO-1、PGE2和IL-10）的表達，從而抑制效應T細胞活性。腫瘤血管的這些特征部分依賴(lài)于VEGF產(chǎn)生及其受體的過(guò)度表達。因此針對VEGFR1和VEGFR2 設計的CAR，通過(guò)限制營(yíng)養和氧氣來(lái)破壞腫瘤血管和減少腫瘤細胞增殖方面顯示出不錯的效果。因此，可以通過(guò)同時(shí)輸注VEGFR2特異性CAR-T細胞和抗原特異性TCR轉導的T 細胞，增加腫瘤特異性T細胞的浸潤、持久性和抗腫瘤活性來(lái)改善腫瘤特異性免疫治療的結果。

       圖2 增強腫瘤運輸和滲透的策略

       ?癌癥相關(guān)成纖維細胞

       癌癥相關(guān)成纖維細胞（CAF）是腫瘤基質(zhì)中最豐富的成分之一，代表了一種反應性的腫瘤相關(guān)成纖維細胞群，它分泌各種活性因子（VEGF和PDGF），促進(jìn)腫瘤的發(fā)展、轉移和治療抵抗。CAF表達可以被免疫療法靶向各種分子，其中FAP是最有希望的靶點(diǎn)。它是一種細胞表面絲氨酸蛋白酶，在人類(lèi)各種癌癥的相關(guān)基質(zhì)細胞（CASC）上高度表達，例如：肺癌、前列腺癌、胰 腺癌、結腸直腸癌和卵巢癌。下圖中描述的策略靶向CAF的關(guān)鍵信號和效應器，旨在抑制CAF的功能，例如細胞因子 (TGFβ) 和生長(cháng)因子途徑 (VEGF、PDGF)。如，可以用單克隆抗體 (MAb) 靶向CAF衍生的細胞外基質(zhì)蛋白（MMP）和相關(guān)信號傳導，以誘導基質(zhì)耗竭和增加免疫T細胞浸潤。FAP靶向旨在阻斷CAF在TME中發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用的能力，可以通過(guò)使用MAb/抗體-藥物偶聯(lián)物、免疫偶聯(lián)物或肽-藥物復合物、FAP特異性CAR-T細胞或基因敲除策略來(lái)完成。

       圖3 抵消 CAF 致瘤效應的策略

       C 存在免疫抑制細胞

       ?調節性T細胞

       Tregs參與腫瘤的免疫抑制環(huán)境，具有免疫抑制特征，例如分泌IL-10和TGF-β，以及競爭效應T細胞增殖所需的IL-2，抑制了注入的T細胞功能。Tregs是高度依賴(lài)IL-2的免疫抑制細胞。它們與周?chē)h(huán)境中的IL-2結合并將其耗盡，從而通過(guò)組成表達高親和力IL-2受體（IL2R）亞基-α（CD25）來(lái)降低T細胞的可用性。Treg細胞還產(chǎn)生免疫抑制細胞因子（IL-10、IL-35和TGFβ），它們可以下調T細胞和抗原呈遞細胞（APC）的活性。此外，Treg細胞釋放大量ATP，ATP 轉化為腺苷（通過(guò)CD39和CD73），可為T(mén)細胞和APC提供免疫抑制信號。

       目前來(lái)消除Treg介導的免疫抑制機制策略主要是CAR-T細胞被設計用于靶向Treg 表達的抗原將其直接消耗。其他策略基于TME的免疫調節以提高CAR-T細胞的性能：（i）CAR-T細胞表達促炎細胞因子；（ii）優(yōu)化共刺激信號結構以減少I(mǎi)L-2分泌并削弱Treg擴增和腫瘤浸潤。最后一種策略就是賦予CAR-T細胞對免疫抑制的內在抵抗力：（i）旨在破壞信號傳導的顯性負性受體 (DNR)，或 （ii）嵌合開(kāi)關(guān)受體 (CSR或Switch R) 將負信號轉化為正信號，或通過(guò)使用基因組編輯工具（敲除）消除抑制性受體（如 TGFβ 受體的 PD1）的表達。

       圖4

       Treg 在 TME 中發(fā)揮免疫抑制的機制 (A)，

       克服 Treg 誘導的免疫抑制的策略（B）

       ?腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）

       巨噬細胞是免疫系統的主要效應細胞之一，在先天性和適應性免疫反應中都發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用，構成抵御外來(lái)病原體的第一道防線(xiàn)，并有助于觸發(fā)適應性抗原特異性反應。巨噬細胞可以分為兩個(gè)對比組：經(jīng)典激活的巨噬細胞或M1巨噬細胞（促炎和抗腫瘤）和交替激活的巨噬細胞或M2巨噬細胞（抗炎和促腫瘤）。這種差異主要是由于暴漏于組織的可溶性因子或病原體衍生分子而引起極化。M1巨噬細胞是促炎細胞，通過(guò)分泌TNFα、IL-1β 和 IL-12 將細胞免疫定向到 TH1型反應在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用。盡管M2巨噬細胞在組織穩態(tài)中發(fā)揮作用（刺激Th2反應以消除寄生蟲(chóng)、免疫調節、傷口愈合和組織修復），但M2巨噬細胞也可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

       腫瘤細胞和基質(zhì)細胞可以分泌多種細胞因子和趨化因子，這些因子可將巨噬細胞募集到腫瘤細胞周?chē)⑺鼈冝D化為T(mén)AM。當巨噬細胞被招募遷移至腫瘤間充質(zhì)中后，可以通過(guò)改變自身的表型，來(lái)適應它們所處的微環(huán)境。TAM是位于TME中的M2樣巨噬細胞的特殊群體，與M1和M2巨噬細胞具有一些共同的表型特征，但具有不同于這兩種類(lèi)型的特定轉錄譜。TAM通過(guò)促進(jìn)遺傳不穩定性和增強血管生成、纖維化、侵襲、免疫抑制和淋巴細胞排斥來(lái)增強腫瘤進(jìn)展和轉移。一方面，巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，如IL-17和IL-23，這增加了遺傳不穩定性，另一方面，它們通過(guò)分泌抑制細胞因子如TGF-β和IL-10，通過(guò)表達免疫檢查點(diǎn)配體如PD-L1、PD-L2、B7-H4 或VISTA或通過(guò)產(chǎn)生活性氧（ROS）,可以阻礙腫瘤免疫監視，從而阻礙T細胞介導的抗腫瘤免疫。

       圖5 克服 TAM 在 TME 中引起抑制的策略

       目前針對巨噬細胞的各種治療策略旨在耗盡或者重新極化巨噬細胞。

       第一種方法是通過(guò)消除現有的TAM或通過(guò)抑制進(jìn)一步的TAM募集來(lái)減少或消耗TAM，這種策略主要通過(guò)定位（i）集落刺激因子1 (CSF1)/CSF1 受體 (CSF1R) 信號通路，（ii）趨化因子/趨化因子受體軸，例如CCL2/CCR2、CCL5/CCR5，（iii）IL-8/CXCR2或（iv）CXCL12 /CXCR4軸實(shí)現。

       第二種方法是通過(guò)抑制PI3Kγ信號通路，通過(guò)TLR激動(dòng)劑觸發(fā)炎癥激活Toll 樣受體（TLR：TLR3、TLR4、TLR7/8和TLR9）信號通路，將TAM重新極化為M1樣表型，或者通過(guò)使用激動(dòng)性抗體CD40抗體實(shí)現。也可以通過(guò)阻斷被稱(chēng)為“don’t eat me”信號的抗吞噬表面蛋白（如SIRPα 或 Siglec-10）來(lái)促進(jìn)TAM的抗原呈遞和吞噬作用，同時(shí)抗體阻斷癌細胞上表達的CD47或CD24。

       第三種靶向TAM的分子是TGF-β，它是一種抗炎細胞因子，通常在損傷消退期間由巨噬細胞表達。巨噬細胞既是TGF的來(lái)源也是靶點(diǎn)，通過(guò)促進(jìn)額外TGF-β的分泌，引起TAM的正反饋回路并維持免疫抑制性TME。通過(guò)TGF-β阻斷靶向TAM已經(jīng)被使用，也可與STING 激動(dòng)劑或抗PDL1阻斷聯(lián)合使用，并在臨床前模型中顯示腫瘤消退。

       第四種方法就是增強腫瘤細胞吞噬作用，最新的研究強調了多種抗原靶向的重要性，它既可以提高CAR-T細胞治療的有效性，又可以減少脫靶反應，例如生成具有靶向CD47和TAG-72的兩個(gè)串聯(lián)CAR的CAR-T細胞。雙重靶向策略使CAR-T細胞破壞表達低抗原水平的腫瘤細胞的能力增強，有利于增加串聯(lián)CAR與腫瘤細胞的親和力。有的研究者研究發(fā)現經(jīng)工程改造的NanoCAR-T 細胞可分泌抗CD47納米抗體能夠抑制腫瘤生長(cháng)，同時(shí)避免全身抗CD47治療遇到的**。與標準CAR-T細胞相比，這種TAM重編程策略顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性。

      ?髓源性抑制細胞

       MDSC是具有免疫抑制性未成熟的骨髓細胞。根據形態(tài)和細胞表面抑制物分為兩種亞型：?jiǎn)魏思毎鸐DSC (M-MDSC) 和多形核/粒細胞MDSC (PMN-MDSC)。它們通過(guò)誘導Tregs和產(chǎn)生精氨酸酶（ARG1）、誘導型NOS（iNOS）和抑制性細胞因子如 IL-10 和 TGF-β，有助于產(chǎn)生腫瘤免疫抑制環(huán)境。目前增加CAR-T細胞對MDSC免疫抑制作用抵抗的策略：（i）防止 MDSC 分化和募集到腫瘤床；（2）消耗腫瘤浸潤性MDSC或（3）減輕MDSC的免疫抑制作用。

       圖6

       MDSC在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制機制(A),

       克服 MDSC 誘導的免疫抑制的策略（B）

       D 免疫檢查點(diǎn)分子和免疫抑制介質(zhì)的表達

       免疫檢查點(diǎn)（IC）通過(guò)調節免疫反應的時(shí)間進(jìn)程和強度，確保維持免疫穩態(tài)。然而，來(lái)自IC的基于受體的信號級聯(lián)在T細胞中發(fā)揮負調節作用，通過(guò)誘導免疫耐受，從而使腫瘤逃避免疫監視。第一個(gè)被確定為T(mén)細胞和CAR-T細胞抑制和凋亡的重要受體的主要IC是CTLA-4和PD-1。在癌癥中廣泛研究的其他免疫受體還有 LAG-3、TIGIT、T細胞免疫球蛋白和含有蛋白3 (TIM3) 的粘蛋白以及B和T淋巴細胞衰減劑 (BTLA)。由于PD1/PD-L1抑制是研究最多的軸，我們來(lái)主要關(guān)注一下CAR-T細胞治療中的PD-1/PD-L1抑制。

       PD-1是B7/CD28家族的成員，它通過(guò)與兩種配體PD-L1和PD-L2相互作用發(fā)揮調節T細胞活性的作用。PD-1/PD-L1結合阻礙IFN-γ和IL-2的合成，從而降低T細胞增殖。為了防止TME中的CAR-T細胞衰竭和免疫抑制可以使用不同的策略，比如：（i）CAR-T細胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI，如抗 PD1 或 PD-L1抗體）的組合；（ii）PD1 介導的抑制也可以通過(guò)設計分泌 PD-1 阻斷或 PD-L1阻斷 單鏈可變片段（scFv）的 CAR-T 細胞來(lái)克服；（iii）設計基因修飾的CAR-T細胞，該細胞表達顯性負PD-1受體 (PD-1 DNR)，干擾PD1下游信號傳導或PD-1嵌合開(kāi)關(guān)受體（CSR），將抑制信號轉變成激活信號。（iv）最后一種策略通過(guò)基因敲除或通過(guò)shRNA（短發(fā)夾 RNA）抑制使PD1表達缺失。

       圖7 CAR-T 細胞克服負性免疫檢查點(diǎn)調節抑制作用的策略（PD1/PD-L1為例）

       總之：腫瘤血管系統和細胞外基質(zhì)等惡性組織的特定性阻礙了CAR-T細胞的滲透，另一方面，調節細胞的存在、免疫檢查點(diǎn)的過(guò)分表達和TME的缺氧條件會(huì )耗盡過(guò)繼轉移的T細胞削弱其抗腫瘤活性。目前所有針對實(shí)體瘤的CAR-T還處于探索階段，并面臨著(zhù)很多的挑戰。期待著(zhù)早日攻克這些難題。