研究表明，靶蛋白的非酶功能在多種細胞信號通路的調控中起著(zhù)關(guān)鍵作用，并與許多人類(lèi)疾病密切相關(guān)。然而，傳統的小分子抑制劑通常直接靶向催化功能域，通過(guò)抑制靶蛋白的酶促功能來(lái)發(fā)揮作用，而不影響非酶功能。近年來(lái)出現的靶向蛋白水解嵌合體PROTAC技術(shù)具有同時(shí)調控靶蛋白的酶功能和非酶功能的優(yōu)勢，從而為改善小分子抑制劑的不足和探索新的治療方案提供了潛在的策略。本文總結了針對靶蛋白非酶功能的PROTAC的最新進(jìn)展，并對未來(lái)發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

       酶的功能及PROTAC介紹

       經(jīng)典的酶通常由酶結構域和非酶結構域組成。酶的功能域是指酶執行其催化功能的具有特定空間結構的區域。具體來(lái)說(shuō)，酶活性位點(diǎn)包含一個(gè)結合區和一個(gè)催化區，它們分別參與底物的結合和催化底物發(fā)生特定化學(xué)反應。而非酶功能區主要通過(guò)蛋白−蛋白相互作用（PPI）來(lái)調節底物蛋白活性，它獨立于催化功能，介導底物與信號通路中不同蛋白成分之間的相互作用，如：變構調控、支架蛋白功能等。

       大量研究表明，各種靶蛋白的非酶功能區域參與了細胞分裂、分化、RNA代謝、DNA修復和基因組穩定性的調控。此外，這些非酶的功能與各種人類(lèi)疾病密切相關(guān)，如癌癥、心血管病，并在調節細胞信號傳導和決定細胞命運中起著(zhù)關(guān)鍵作用。然而，傳統的小分子抑制劑通常直接靶向酶的催化功能域，并通過(guò)抑制靶蛋白的酶促功能來(lái)發(fā)揮治療效果。然而，這些抑制劑通常不能阻斷靶蛋白的非酶功能，并且面臨著(zhù)選擇性低、特異性差、臨床療效有限和耐藥性等問(wèn)題。

       靶向蛋白降解技術(shù)（TPD）被認為是一種富有治療前景且極具吸引力的治療策略。PROTAC通常由三部分組成：靶蛋白配體，E3泛素連接酶配體，以及連接鏈。PROTAC可以招募E3泛素連接酶，通過(guò)泛素−蛋白酶體系統（ups）促進(jìn)靶蛋白的泛素化，進(jìn)而降解。

       與傳統的直接抑制靶蛋白的藥物開(kāi)發(fā)策略不同，PROTAC通過(guò)調節宿主蛋白降解系統來(lái)發(fā)揮作用。此外，PROTAC可以誘導整個(gè)靶蛋白的降解，可以同時(shí)阻斷靶蛋白的酶功能和非酶功能（圖1）。因此，通過(guò)PROTAC策略阻斷靶蛋白的非酶功能可能是解決傳統小分子抑制劑所面臨的疾病治療問(wèn)題的一種新的和富有治療前景的策略。

       圖1.靶向酶結構的PROTAC技術(shù)

       阻斷表觀(guān)遺傳靶標非酶功能的PROTAC

       1 靶向EZH2的PROTAC

       表觀(guān)遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列在不發(fā)生改變的情況下，基因表達的可遺傳修飾。表觀(guān)遺傳修飾的異常廣泛存在于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，是抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的研究熱點(diǎn)。

       PRC2是多組合組蛋白中的一員，是表觀(guān)遺傳癌癥治療的重要靶點(diǎn)，具有組蛋白甲基轉移酶活性。PRC2復合物由EZH2、EED、SUZ12、RbAp46/48四個(gè)主要成員組成。PRC2復合物的過(guò)度激活通過(guò)沉默腫瘤抑制基因而誘導惡性腫瘤，EZH2是PRC2的一個(gè)核心和多功能的催化亞基，在多種癌癥類(lèi)型中過(guò)表達，如肺癌、膀胱癌和乳腺癌。EZH2通過(guò)甲基化組蛋白H3的27位賴(lài)氨酸來(lái)抑制腫瘤抑制基因的表達。

       近年來(lái)，通過(guò)直接或間接靶向EZH2的抑制劑的開(kāi)發(fā)取得了重大進(jìn)展。越來(lái)越多的證據表明，EZH2的致癌功能并不完全依賴(lài)于其酶活性。除了催化H3K27me和介導與各種細胞過(guò)程相關(guān)的基因沉默外，EZH2還介導多種癌癥中基因的激活，這些基因與EZH2/PRC2的酶促功能無(wú)關(guān)。

       然而，目前所報道的EZH2抑制劑僅通過(guò)靶向其組蛋白甲基轉移酶活性來(lái)下調H3K27me3的水平。由于對EZH2致癌活性的抑制作用不足，EZH2抑制劑的臨床療效有限，且僅對某些癌癥有效。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種新的靶向EZH2的治療策略。

       靶向蛋白降解策略PROTAC為完全阻斷EZH2的致癌活性提供了新的機會(huì )。

       最近，四川大學(xué)yu課題組通過(guò)將EZH2選擇性抑制劑EPZ6438與CRBN配體沙利度胺通過(guò)連接鏈連接，設計合成了EZH2 PROTAC 1（圖2）。實(shí)驗結果表明，化合物1可以完全抑制EZH2的致癌活性。其中，化合物1對PRC2亞基表現出顯著(zhù)的降解效率，72h降解完全。研究發(fā)現，化合物1直接與EZH2蛋白結合，而不是SUZ12、EED和RBAP48。因此，化合物1可以將E3泛素連接酶招募到PRC2復合物附近，導致EZH2的泛素化和降解。EZH2介導的間接相互作用誘導了蛋白酶體對其他PRC2亞基的降解，包括EED、SUZ12和RBAP48。然而，由于PRC2亞基的選擇性較差，化合物1可能具有潛在的毒 性或副作用。未來(lái)對化合物1的研究應集中于如何提高蛋白降解的靶點(diǎn)選擇性。

       圖2.靶向EZH2 PROTAC 1結構

       溫課題組將選擇性EZH2抑制劑EPZ6438和VHL配體通過(guò)連接鏈進(jìn)行連接，獲得了選擇性的EZH2降解劑YM281 (3)和YM181 (4)。實(shí)驗結果表明，這兩個(gè)EZH2 PROTAC可以靶向淋巴瘤中整個(gè)EZH2，通過(guò)降解EZH2，進(jìn)而阻斷EZH2的非酶功能（圖3）。此外，EZH2 PROTAC顯著(zhù)降低了H3K27me3的水平，并誘導了細胞周期阻滯和凋亡。與此同時(shí)，對抑制劑EPZ6438耐藥的淋巴瘤細胞系表現出完全的抑制作用，在體內抗腫瘤模型中也表現出較好的抑制效果。

       圖3. 靶向EZH2 PROTAC YM281 (3)和YM181 (4)的化學(xué)結構

       由于EZH2-PRC2和EZH2-TAD-cMyc-coactivator這兩種EZH2復合物對EZH2介導的促癌功能都非常重要，造成了目前EZH2抑制劑在腫瘤治療中的局限性。cMyc是一種難以被小分子靶向的致癌因子，它與EZH2有直接的PPI作用，并且獨立于PRC2復合物。

       因此，研究人員使用PROTAC技術(shù)設計了降解劑MS177 (5)（圖4），它可以同時(shí)針對EZH2的酶功能和非酶功能。實(shí)驗結果表明，化合物5降解了PRC2復合物成分（包括EZH2、SUZ12、EED），下調了H3K27me3的水平，抑制了依賴(lài)于PRC2的傳統酶促功能。此外，它還能有效降解cMyc，抑制EZH2的非酶促功能。

       圖4. MS177 和MS8815的化學(xué)結構

       金堅團隊開(kāi)發(fā)了一種EZH2選擇性降解劑MS8815 (7)，以探索其在三陰性乳腺癌（TNBC）細胞中的作用。實(shí)驗結果表明，化合物7在乳腺癌細胞系MDA-MB-453細胞中實(shí)現了EZH2的高效降解（DC50 = 140 nm）。此外，化合物7在多個(gè)TNBC細胞系中均具有良好的抗增殖活性。因此，化合物7的開(kāi)發(fā)克服了傳統靶向催化位點(diǎn)抑制劑僅針對TNBC細胞中EZH2的催化功能域的局限性。

       2 靶向HDAC6的PROTAC

       組蛋白去乙?；?（HDAC6）是HDAC家族中的一個(gè)微管相關(guān)成員，主要位于細胞質(zhì)中，參與調節錯誤折疊蛋白的降解、細胞形態(tài)和遷移。HDAC6的異常調控與癌癥、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病等多種疾病密切相關(guān)。已知的HDAC6選擇性抑制劑通過(guò)結合HDAC6的C端催化結構域來(lái)阻斷酶的功能。然而，由于HDAC6中存在多個(gè)結構域（圖5），如C端泛素結合域（UBD）、N端催化結構域和鋅指泛素結合域（ZNF-UBP），目前有多達45個(gè)HDAC6抑制劑未能靶向這些功能域。因此，迫切需要新的針對HDAC6的研發(fā)策略。

       圖5. HDAC6 的結構域

       目前已經(jīng)成功報道了多種靶向HDAC6的PROTAC（圖6）。其中，化合物9是基于VHL配體的PROTAC，化合物12-14是基于CRBN配體的PROTAC（化合物13和14是陰性對照）。這些PROTAC都表現出顯著(zhù)HDAC6的降解效果和抑制腫瘤細胞生長(cháng)的效果。這些降解劑通過(guò)誘導整個(gè)靶蛋白的降解，同時(shí)阻斷HDAC6的酶促功能和非酶促功能。

       圖6.靶向HDAC6 PROTAC化學(xué)結構

       阻斷腫瘤代謝靶點(diǎn)非酶功能的PROTAC

       煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（NAMPT）是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）生物合成的關(guān)鍵酶，其在腫瘤代謝和炎癥中起關(guān)鍵作用。除了在腫瘤細胞的增殖和分化中的功能外，NAMPT還由于其細胞因子樣作用而影響免疫微環(huán)境。

       NAMPT被稱(chēng)為“雙側蛋白”，分為胞內NAMPT（iNAMPT）和胞外NAMPT（eNAMPT）兩種類(lèi)型。研究表明，NAMPT抑制劑僅阻斷其酶功能，而不通過(guò)eNAMPT調節非酶功能。僅僅抑制NAMPT的酶功能不足以完全抑制NAMPT的致癌功能。由于有限的抗腫瘤功效和劑量依賴(lài)性毒 性(例如血小板減少和胃腸道副作用)，兩種NAMPT抑制劑(FK866和CHS-828)的臨床試驗停止。因此，迫切需要新的策略來(lái)干擾NAMPT的非酶功能。

       盛春泉課題組報道了第一個(gè)可以降解NAMPT并減少eNAMPT分泌的PROTAC 15（圖7）, 化合物15通過(guò)UPS途徑直接降解iNAMPT，從而減少eNAMPT的分泌，促進(jìn)抗腫瘤免疫，從而阻斷NAMPT的酶和非酶功能。在腫瘤小鼠模型中，化合物15也表現出較好的抑制效果。

       此外，化合物15能以較低的細胞毒 性和更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性激活免疫反應。PROTAC 15的開(kāi)發(fā)使我們更好地了解NAMPT的非酶功能在重建免疫抑制腫瘤微環(huán)境中的作用，從而促進(jìn)了NAMPT靶向腫瘤免疫治療方法的發(fā)展。

       圖7. 靶向NAMPT PROTAC 15的化學(xué)結構

       阻斷激酶非酶功能的PROTAC

       1 靶向有絲分裂激酶AURORA-A的PROTAC

       有絲分裂激酶AURORA-A在有絲分裂過(guò)程中對各種蛋白質(zhì)的磷酸化起著(zhù)重要作用，其催化活性對整個(gè)細胞周期而言至關(guān)重要， AURORA-A被認為是抗癌藥物發(fā)現的重要靶點(diǎn)。然而由于低臨床應答率，AURORA-A激酶抑制劑的開(kāi)發(fā)一直停滯不前。研究表明，AURORA-A的非酶功能區可以與MYC家族的原癌基因蛋白結合，使得N-MYC和C-MYC不能被蛋白酶體降解。并且，AURORA-A激酶抑制劑不足以消除AURORA-A的致癌活性。

       為了探索AURORA-A激酶的非酶功能，Wolf課題組將AURORA-A臨床抑制劑alisertib17與CRBN的E3連接酶配體結合，開(kāi)發(fā)了PROTAC JB170（圖8）。研究發(fā)現，JB170可誘導AURORA-A的快速、有效和高度特異性降解。AURORA-A的酶活性被認為主要在細胞周期的G2/M期起作用，而其在S期的功能可能與其酶活性無(wú)關(guān)。作者發(fā)現，化合物18可以誘導強烈的S期阻滯，但對G2/M期的細胞聚集沒(méi)有明顯的影響。此外，作者也通過(guò)實(shí)驗證明了化合物18阻滯S期主要由DNA復制過(guò)程中AURORA-A的非酶功能引起。

       圖8. JB170的化學(xué)結構

       2 靶向FAK的PROTAC

       FAK是介導生長(cháng)因子受體和整合素相關(guān)信號轉導的細胞質(zhì)蛋白酪氨酸激酶。FAK主要由三個(gè)結構域組成：N-末端FERM結構域、中心激酶結構域和C-末端局部粘附靶向(FAT)結構域（圖9）。雖然傳統的FAK抑制劑只作用于蛋白激酶結構域以阻斷酶功能，但FAK的非酶功能在癌癥的發(fā)展和進(jìn)展中也是關(guān)鍵的，并且不能被報道的FAK抑制劑阻斷。因此，同時(shí)抑制FAK的激酶依賴(lài)性酶功能和激酶非依賴(lài)性支架功能是抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的新的研究方向。

       圖9.FAK的生物結構特征

       耶魯大學(xué)Crews課題組開(kāi)發(fā)了一種靶向FAK PROTAC 19?；衔?9通過(guò)1，2，3-三唑的聚乙二醇(PEG)，將FAK抑制劑defactinib（20)和 VHL配體進(jìn)行連接而成。PROTAC 19在低納摩爾濃度下選擇性降解（DC50=3.0nM，Dmax=99%）。除影響其激酶依賴(lài)性信號活性外，FAK的降解還減弱其激酶依賴(lài)性信號。例如，由于FAK介導的細胞運動(dòng)性主要由激酶非依賴(lài)性途徑控制，去除FAK顯著(zhù)阻礙了TNBC細胞的遷移和侵襲能力。

       圖10. 化合物19的化學(xué)結構

       清華大學(xué)饒燏課題組開(kāi)發(fā)了FAK PROTAC FC-11（圖11），并在此基礎上進(jìn)一步研究了FAK的非酶功能。實(shí)驗結果發(fā)現，FC-11可以有效、快速和可逆地降解FAK。同時(shí)，FC-11能有效降解小鼠生殖系統中的FAK，并顯著(zhù)下調磷酸化FAK蛋白水平。

       圖11.FC-11的化學(xué)結構

       Law研究團隊設計了一種高效、選擇性的FAK降解劑GSK215。研究人員將VHL配體和臨床FAK抑制劑VS-471通過(guò)剛性且短的連接鏈進(jìn)行連接而成?；衔颎SK215誘導小鼠肝 臟中FAK的持續降解和延長(cháng)的PK/PD效應(18小時(shí)內Dmax為85%，96小時(shí)給藥后FAK水平降低60%）。值得注意的是，研究人員通過(guò)構效關(guān)系（SAR）和X射線(xiàn)晶體學(xué)分析表明，化合物GSK215具有較高的降解能力源于一種不尋常的短而剛性的連接鏈，并產(chǎn)生高度協(xié)同的三元復合物。

       圖12. FAK降解劑GSK215的化學(xué)結構

       針對其他靶點(diǎn)非經(jīng)典功能的PROTAC

       1 靶向FKBP12的PROTAC

       肺動(dòng)脈高壓（PAH）是先天性心臟病最常見(jiàn)、最嚴重的并發(fā)癥，也是心血管疾病防治的主要問(wèn)題。近年來(lái)的研究發(fā)現，鐵在多環(huán)芳烴的發(fā)生和發(fā)展中起著(zhù)至關(guān)重要的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是PAH中的關(guān)鍵蛋白之一，參與調節人體內鐵代謝平衡的關(guān)鍵蛋白hepcidin的表達。

       FK506結合蛋白12(FKBP12)可結合BMP I型受體并隨后抑制hepcidin。FKBP12的這種非經(jīng)典功能類(lèi)似于非酶功能，因為它以與催化劑無(wú)關(guān)的方式調節其與細胞信號途徑的不同組分的相互作用。目前報道的免疫抑制劑雷帕霉素和FK506阻斷FKBP12與BMP I型受體的結合，從而增加hepcidin。然而，在臨床使用中，FKBP12抑制劑表現出免疫抑制副作用。

       饒燏課題組報道了PROTAC RC32（圖13）。RC32是由雷帕霉素與泊馬度胺連接而成。在小鼠模型中，化合物RC32通過(guò)激活BMP信號，成功地實(shí)現了hepcidin基因表達的上調。與雷帕霉素（24) 或FK506 (25），化合物RC32無(wú)免疫抑制活性。這項工作證實(shí)了PROTAC介導的FKBP12非經(jīng)典功能降解治療低hepcidin相關(guān)疾病的可靠性。

       圖13. RC32 的化學(xué)結構

       2 靶向USP7的PROTAC

       作為一種重要的抑癌因子，p53是癌癥中最頻繁突變的基因之一。P53在人類(lèi)癌癥中突變率大于50%。研究發(fā)現，突變之后的p53不僅失去對細胞正常生物學(xué)功能的調節，而且抑制野生型p53蛋白的功能，從而導致細胞癌變。因此，開(kāi)發(fā)新的藥物來(lái)治療p53突變癌癥仍然是一個(gè)緊迫的問(wèn)題。然而，p53的突變是相對隨機的，這使得開(kāi)發(fā)直接針對p53突變體的靶向藥物非常困難。

       泛素特異性蛋白酶7 (USP7) 通過(guò)去泛素化和穩定MDM2，在調節p53含量中起關(guān)鍵作用。最近，上海藥物所周兵課題組設計合成了第一代小分子降解劑U7D-1（圖14)，U7D-1可有效且選擇性地降解USP7（DC50=33 nM）?；衔颱7D-1表現出與USP7抑制劑相當或更強的對p53野生型癌細胞生長(cháng)的抑制活性，尤其是在p53突變癌細胞(Jeko-1細胞，IC)中也顯示出顯著(zhù)的抗增殖活性，而USP7抑制劑27顯示弱活性。進(jìn)一步的作用機理研究表明，U7D-1可能通過(guò)調節USP7的非酶功能區（凋亡和E2F途徑）誘導USP7降解，從而發(fā)揮對p53突變癌細胞的抗腫瘤活性。

       圖14. 靶向USP7 PROTAC U7D-1的化學(xué)結構

       小結

       近年來(lái)，靶蛋白的非酶功能日益受到關(guān)注。由于PROTAC可以同時(shí)阻斷靶蛋白的酶和非酶功能，且不長(cháng)時(shí)間占據酶結合口袋以誘導整個(gè)蛋白的降解的優(yōu)勢而備受矚目。

       目前的研究表明，PROTAC在研究靶蛋白的非酶功能方面顯示出良好的優(yōu)勢，并發(fā)揮了有效的治療作用。相比于小分子抑制劑，PROTAC具有更高的靶選擇性、更強的療效、更低的耐藥風(fēng)險和延長(cháng)的作用。

       因此，PROTAC介導的藥物靶標的酶和非酶功能的抑制可導致藥物活性的顯著(zhù)提高，提供了新的治療策略，也為研究靶蛋白的非酶功能和相關(guān)疾病的機制提供了基礎。盡管目前PROTAC對非酶功能的研究還處于起步階段，還需要更多的研究來(lái)發(fā)現更多的策略，以調節靶蛋白的非酶功能。但我們依然相信，利用PROTAC阻斷蛋白質(zhì)的非酶功能可能成為藥物開(kāi)發(fā)的新方向，前景一片光明。

       參考文獻

       1、Blocking Non-enzymatic Functions by PROTAC-Mediated Targeted Protein Degradation. doi.org/10.1021/acs.jmedchem.2c01159

       2、Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) for Epigenetics Research. Curr. Opin. Chem. Biol. 2020, 57, 8?16.

       3、Discovery of a Potent and Selective Degrader for USP7. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 2022, 134 (33), e202204395.

       4、Targeting the Non-Catalytic Functions: a New Paradigm for Kinase Drug Discovery? J. Med. Chem. 2022, 65, 1735?1748.

       5、Strategies for Designing Proteolysis Targeting Chimaeras (PROTACs). Med. Res. Rev. 2022, 42, 1280?1342.(15) Wang, Y.; Jiang, X.; Feng,