自2019年沙坦亞硝胺污染事件后，FDA 和 EMA 明顯加大了對藥品潛在誘變雜質(zhì)的監管力度。不僅屢次發(fā)文至其監管的制藥公司與 CDMO，而且為很多藥物基質(zhì)亞硝胺雜質(zhì)設定了非常嚴格的 ADI (每日允許攝入量)，例如18 ng/天。

       亞硝胺風(fēng)波尚未平息，苯污染又成為了監管機構鳴響的另一次警笛。

       藥品生產(chǎn)過(guò)程中使用或產(chǎn)生的很多物質(zhì)都有可能是潛在誘變雜質(zhì)（PMI），例如很多烷基化試劑，包括氯代烷烴，它們的使用，或者作為雜質(zhì)產(chǎn)生于反應的過(guò)程中，都可能給藥物帶來(lái)PMI污染的風(fēng)險。面對產(chǎn)品安全與PMI管理的可操作性，從業(yè)者需要一種合理的手段實(shí)現兩者之間的平衡。

       本文將著(zhù)重介紹 PMI 的 purge factor與purge ratio 概念，它們的計算方法，以及隨之而來(lái)的 PMI 控制方法。

       什么是 Purge Factor

       Purge Factor (PF) 反映工藝降低雜質(zhì)水平的能力。根據 ICH M7(R1)，它被定義為工藝上游點(diǎn)的雜質(zhì)水平除以工藝下游點(diǎn)的雜質(zhì)水平。PF既可以通過(guò)測量也可以通過(guò)預測的手段實(shí)現（PS：需要提前強調的是，Purge Factor 和 Purge Ratio 是兩個(gè)不同的概念，下文將具體介紹兩者的差別和聯(lián)系）。

       Purge Factor (PF) 計算：基本原則

       PF的計算值是根據目標的潛在基因毒 性雜質(zhì)，或潛在誘變雜質(zhì)（PMI, potential mutagenic impurity; 或PGI, potential genotoxic impurity）的自身物理化學(xué)性質(zhì)，以及所處工藝的特征共同決定的（步驟如下圖所示）。

       第一步是評價(jià)可以決定PF的清除程度的關(guān)鍵要素，例如它的反應活性、溶解度、揮發(fā)度，以及能夠將其排除出體系的工藝操作，例如色譜純化；

       第二步是根據這些特性，對他們進(jìn)行評分；

       第三步是PF的計算，即將上述評分乘積；

       第四步對比所得的預測PF和所需PF閾值，以決定PMI最終污染產(chǎn)品的可能性。

       注：

•        PMI的化學(xué)活性評分可分三個(gè)檔次：1， 10， 100。該評分可以通過(guò)已存在的實(shí)驗數據，或者參與評分者的知識體系決定。
•        PMI的揮發(fā)度是基于所在溶劑的沸點(diǎn)與PMI的沸點(diǎn)比較給出的。
•        PMI的溶解度是基于PMI形成于反應體系，因此會(huì )保留在母液這個(gè)考慮做出的，但要考慮以下因素（保守估計）：

1.        PMI在純溶劑中的溶解度，與反應結束時(shí)，或者workup時(shí)的情況可能不一致；
2.        結晶過(guò)程可能沒(méi)有得到很好的控制，因此PMI即便在母液中具有較高溶解度，也有可能與產(chǎn)物共同析出。

•        以上的評分體系，大的原則傾向于保守估計PMI的PF。

       表1. PF評分系統ICH指南

       案例分析：AZ9056醛

       制備AZD9056 HCl的工藝，使用了AZD9056醛作為反應物?？紤]到這個(gè)反應物含有醛基，因此它可能成為最終產(chǎn)物中的PMI。該工藝過(guò)程如下圖所示。

       AZD9056 HCl合成路線(xiàn)

       圖片來(lái)源：Lhasa Limited

•        第一步：還原胺化

1.        化學(xué)活性：100 （基于工藝控制，例如反應轉化率）
2.        溶解度：1 （沒(méi)有中間物分離過(guò)程，因此沒(méi)有清除效果）
3.        揮發(fā)度：1（不揮發(fā)）

•        第二步：HCl 鹽分離

1.        化學(xué)活性：1
2.        溶解度：10 （目標產(chǎn)物AZD9056 HCl被分離，殘余醛保留在溶液中）
3.        揮發(fā)度：1

       需要注意的是，除了反應物醛AZD9056之外，這個(gè)工藝中還產(chǎn)生了兩個(gè)潛在的遺傳毒 性雜質(zhì)：異丙基氯（isopropyl chloride）和AZD9056 chloride。他們都是烷基氯代化合物，因此從結構上看也屬于PMI的行列，因此不能忽略，需要一并分析。

       對于這三個(gè)篩選出來(lái)的 PMI 的 PF 評分詳情見(jiàn)表2?？梢钥闯?，AZD90956醛和異丙基氯都具有很高的PF預測值。前者得益于多重步驟可以去除，這也解釋了越下游的PMI產(chǎn)生，其危險性就越高的原因，例如沙坦事件中的亞硝胺雜質(zhì)，就是產(chǎn)生在化學(xué)反應的最后一步。

       異丙基氯盡管形成在第二步，但得益于其較低的沸點(diǎn)（因而揮發(fā)度得分較高），也取得了10000的預測PF。與此相反的是，AZD9056 chloride的預測PF只有3?；诖藵撛诘母唢L(fēng)險，研發(fā)人員通過(guò)測量的方式獲取了其更為準確的PF，其值為10。至于這個(gè)數值是否可以保證AZD9056 chloride的含量控制在相應的閾值之下，就需要結合具體的工藝，以及該藥物的給藥方式和劑量來(lái)進(jìn)行評估和判斷。

       表2. AZD9056醛、AZD9056 chloride和異丙基氯的PF預測

•        如何為活性打分

       注：以上打分不僅要考慮反應過(guò)程，也需要將work-up步驟考慮進(jìn)去。如果沒(méi)有實(shí)驗數據，也可以參考類(lèi)似化合物或反應、參考文獻，或者依靠專(zhuān)家經(jīng)驗。

•        如何為溶解度打分

       如何使用PF

       上文已經(jīng)提示過(guò)，Purge Factor和Purge Ratio是兩個(gè)既不相同又高度關(guān)聯(lián)的內容。Purge factor的計算，可以說(shuō)是為了引出Purge Ratio做鋪墊，而后者將是決定應該采用何種策略管理生產(chǎn)工藝中引入或產(chǎn)生的PMI的決定因素。

       Purge Ratio 的定義是“預測或測量的PMI的PF與所需要的Purge Factor之間的商”。

       這個(gè)定義中又引入了一項新的內容，即：需要的PF。那么什么是需要的PF?

       簡(jiǎn)單地說(shuō)，需要的PF就是保證最終藥物中PMI含量達標的PF值。它的定義為：反應中PMI的最大濃度（ppm，比如PMI反應物完全沒(méi)有轉化，或者一個(gè)反應物完全轉化為了一個(gè)PMI雜質(zhì)的情況下的濃度）與API中該PMI所允許的質(zhì)量標準（ppm）之間的商。

       在ICH M7: Control Strategy Option for Mutagenic Impurities一章中，對于如何控制PMI提出了四個(gè)選擇，具體內容見(jiàn)下圖。

       ICH M7四種PMI的控制策略

       從上圖可以看出，四種選擇是按照寬松度增加的順序排列的。選擇1需要在A(yíng)PI中測量實(shí)際的PMI含量；選擇2可以測量中間品，或者原料的PMI濃度，而且需要按照最終API的質(zhì)量標準；選擇3針對中間品，但可以放寬最高濃度限制，當然這是建立在對于工藝能力掌握的基礎之上，以Purge Ratio作為依據進(jìn)行的；選擇4則無(wú)需做任何檢測，這也是建立在對工藝了解的基礎之上，而且Purge Ratio達到一個(gè)標準的前提下做出的決定。

       具體來(lái)說(shuō)，1000是Purge Ratio的一個(gè)分水嶺：如果Purge Ratio大于1000的話(huà)，可以按照選擇4的內容進(jìn)行PMI控制，即無(wú)需做任何分析；當Purge Ratio小于1000的話(huà)，則要根據情況選擇1-3的內容進(jìn)行PMI分析。其決定樹(shù)見(jiàn)下圖。在關(guān)鍵的雜質(zhì)是否被清除的標準上，采用的正是Purge ratio大于1000的原則。

       是否需要測量PMI的決定樹(shù)

       ICH M7關(guān)于PMI控制的示范

       讓我們通過(guò)一個(gè)案例來(lái)說(shuō)明如何通過(guò)Purge Ratio的標準，來(lái)選擇對于PMI的控制途徑。

1.        假設有一個(gè)PMI物質(zhì)X產(chǎn)生于某個(gè)工藝，而這個(gè)PMI的身份是原料（盡管PMI的名稱(chēng)是潛在誘變雜質(zhì)，但如果反應物就是具有誘變性的物質(zhì)的話(huà)，那么在毒理學(xué)家眼里它就是個(gè)雜質(zhì)）。
2.        假設這個(gè)PMI物質(zhì)X以1當量投入反應體系，并且初始濃度為106ppm。
3.        為了實(shí)現X在最終API中的含量小于TTC 100 ppm（The Threshold of Toxicological Concern，毒理學(xué)關(guān)注閾值。如果人體對某種物質(zhì)的暴露低于 TTC 值，則認為產(chǎn)生不利影響的可能性非常低），需要104的Purge Factor (注意，是PF而不是Purge Ratio)。該值是通過(guò)106/100 ppm得到的（參加上文Eq. 2）。需要注意的是，這個(gè)算法中，假設了X完全保留下來(lái)，沒(méi)有產(chǎn)生任何化學(xué)轉化。這當然是一種最保守的估算方法，這個(gè)要求在上文也做了說(shuō)明。
4.        為了實(shí)現1000的Purge Ratio (此處是Purge Ratio) 的閾值，預測出的X的Purge Factor（此處又成了Purge factor）必須大于107（即103=107/104，參見(jiàn)Eq. 1）

       如果預測的Purge Factor（PF）值大于107，那么便可以選擇ICH M7中的選項4，即不用對PMI做任何形式的測定；反之，如果PF小于107，則需要視具體情況而選擇1-3的選項（也有某些Purge ratio小于1000而選擇選項4的情況，見(jiàn)下文），測量產(chǎn)品、中間品或者原料中的PMI含量：

•        Purge Ratio>1000 （建議選擇4）

1.        不必需要收集額外數據來(lái)證明PMI控制；
2.        在非商業(yè)API的監管報告中注明PMI “unlikely to persist（不太可能保留）”；在商業(yè)監管報告中，標明預測的PF和Purge Ratio。

•        100<Purge Ratio<1000 （建議選擇4）

1.        無(wú)論商業(yè)還是非商業(yè)監管報告，都應該提供額外的實(shí)驗數據（溶解度、活性和揮發(fā)性數據）；
2.        無(wú)需提供PMI含量分析數據；
3.        在遞交非商業(yè)監管報告中，呈遞預測PF和Purge Ratio值；
4.        在商業(yè)監管報告中，呈遞具體的PF計算過(guò)程，Purge Ratio計算過(guò)程，以及支持數據。

•        Purge Ratio<100 （選擇1-3）

1.        對于非商業(yè)化的API 生產(chǎn)，建議提供實(shí)驗確定的PMI清除數據，包括PMI含量分析；
2.        如果Purge Ratio遠小于100而仍然希望選擇4的話(huà)，需要提供額外的實(shí)驗數據以做支持；
3.        提交非商業(yè)化API的監管報告時(shí)，需要提供預測PF值過(guò)程的關(guān)鍵參數、Purge Ratio的計算過(guò)程，以及支持性的數據，甚至PMI測定數據；
4.        提交商業(yè)化API的監管報告時(shí)，需要提供上述的完整數據；
5.        如果數據足夠充分的話(huà)，可以使用選擇4，否則將采取選擇1-3。

       Ref.

       Borths, C. J. et al. Control of Mutagenic Impurities: Survey of Pharmaceutical Company Practices and a Proposed Framework for Industry Alignment. Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 831-837.

       Elder, D. P. et al. Is Avoidance of Genotoxic Intermediates/Impurities Tenable for Complex, Multistep Syntheses? Org. Process Res. Dev. 2015, 19, 1437-1446.

       Why you should consider controlling your potentially mutagenic impurities outside the lab. Lhasa Limited.