Deltazinone是一種高效的小分子KRAS-PDEδ抑制劑，在KRAS-PDEδ蛋白-蛋白相互作用（PPI）的研究中被廣泛用作先導化合物或工具分子。近期，藥物開(kāi)發(fā)人員對Deltazinone進(jìn)行了疏水標簽（HyT）標記，開(kāi)發(fā)了一類(lèi)新型PDEδ降解劑，該降解劑在結腸癌的治療上顯示出了較大的應用前景。
圖一 新型HyT-PDEδ降解劑的設計與合成
Deltazinone與PDEδ的預測結合模型表明，末端苯胺暴露在蛋白表面（圖一B），為引入HyT基團提供了一個(gè)有利的位點(diǎn)。此外，末端苯胺的結構修飾對其與PDEδ的結合親和力影響不大。例如，用安非 他明基團取代Deltazinone中的苯胺（化合物8），結合親和力可以保持。因此，研發(fā)人員使用帶連接體的HyT基團（金剛烷胺）標簽取代末端苯基，設計合成了一系列PDEδ降解劑。研發(fā)人員指出，理論上，金剛烷胺HyT可以模擬PDEδ蛋白的錯誤折疊，未折疊的蛋白被泛素蛋白酶體系統識別和降解，從而阻斷KRAS-PDEδ蛋白相互作用。
得到化合物15a-17f后，研究人員首先采用熒光偏振（FP）結合試驗來(lái)研究所有靶標PDEδ的結合親和力。如圖二所示，大部分目標化合物表現出了良好的結合活性。具有短連接子的化合物15a具有良好的PDEδ結合親和力（Ki = 13.6 nM）。具有一個(gè)碳原子連接子延伸的化合物15b表現出輕微增強的PDEδ結合活性（Ki = 9.3 nM）。隨后，進(jìn)一步合成和評價(jià)了含有各種連接物的化合物。然而，隨著(zhù)烷基連接體長(cháng)度的增加，化合物16a和16b的結合活性分別降低到41和44.1 nM。通過(guò)引入苯基，設計了化合物16c-16e，以增強連接子的剛性。然而，它們的結合親和力顯著(zhù)降低。這些結果表明，長(cháng)烷基連接體可能不利于PDEδ的結合。最后，將末端酰胺基團反轉，得到化合物17a-17f。其中，17c和17d兩種化合物具有良好的結合活性，Ki值分別為26和29 nM。
圖二 熒光偏振（FP）結合試驗及抗增殖活性測試
考慮到結合活性，研究人員進(jìn)一步通過(guò)Western blot分析進(jìn)一步評估了所有目標化合物對SW480細胞系（KRAS突變的人結腸癌細胞）中PDEδ降解的影響。如圖三A所示，化合物15a、16a和17c-17e在濃度為10 μM的情況下，顯著(zhù)誘導了SW480細胞中PDEδ的降解。其中，化合物17c的降解活性最好（在10μM時(shí)降解率約為86%）。當濃度降低到1 μM時(shí)（圖三B），化合物15a、16a和17c-d保持了降解活性。其中，化合物17c的降解活性仍然最好（在1μM時(shí)降解率約為79%）。此外，研究人員還探討了化合物17c的劑量依賴(lài)性效應（圖三C）。結果表明，化合物17c在SW480細胞中表現出顯著(zhù)的PDEδ降解，在24 h后DC50（濃度導致50%蛋白質(zhì)降解）值為11.4 μM。
圖三 Western blot分析實(shí)驗
接下來(lái)，研究人員研究了受PDEδ調控的下游蛋白（圖四A，B）。與陽(yáng)性藥物一致的是，化合物17c可以以濃度依賴(lài)性的方式下調p-Akt和p-Erk，而對t-Akt和t-Erk的表達影響不大。這些結果表明，化合物17c能有效降解SW480癌細胞中的PDEδ，進(jìn)而導致下游通路的改變。
圖四 化合物17c的抗腫瘤機制
鑒于目標化合物具有強大的PDEδ結合活性和降解效率，研究人員通過(guò)CCK8實(shí)驗研究了目標化合物對兩種不同的KRAS突變的人結腸癌細胞（SW480和HCT116細胞系）的抗增殖活性（圖二）。結果表明，大部分靶標化合物對SW480細胞的抗增殖活性均高于HCT116細胞。與PDEδ抑制劑Deltazinone相比，幾種Hyt降解劑的抗腫瘤活性有所改善（例如，化合物16a、16e和17a-17e）。其中，化合物17c（SW480半抑制濃度= 4.8 μM；HCT116半抑制濃度= 7.7 μM）具有更好的抗增殖活性。重要的是，化合物17c的體外抗腫瘤效果與PDEδ的降解效率和結合活性基本一致。此外，研究人員采用Annexin V/PI染色的流式細胞術(shù)檢測，闡明化合物17c的抗腫瘤作用機制。如圖四C和D圖所示，化合物17c在處理24 h后顯著(zhù)誘導SW480細胞凋亡。在濃度為40 μM時(shí)，化合物17c的凋亡率為83.67%，優(yōu)于Deltazinone（50μM時(shí)凋亡率為5.4%）。
綜上，HyT技術(shù)是一種靶向降解PDEδ的可行策略，基于Hyt的降解劑17c具有強大的PDEδ結合親和力、PDEδ蛋白降解活性和抗增殖活性，是一款頗具前景的結腸癌治療藥物分子。
參考文獻：
Hydrophobic Tagging-Induced Degradation of PDEδ in Colon Cancer Cells，ACS Med. Chem. Lett. 2022, 13, 298-303
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