2023年4月24日，國家藥典委員會(huì )官網(wǎng)發(fā)布“關(guān)于通則0512高效液相色譜法修訂草案的公示”，擬對2020年版《中國藥典》第三部第456頁(yè)暨第四部第61頁(yè)收入的方法——0512高效液相色譜法部分內容進(jìn)行修訂，公示期自發(fā)布之日起3個(gè)月。高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC）是色譜法的一個(gè)重要領(lǐng)域之一，HPLC具有分析速度快、分離效能高、檢測靈敏度好等特點(diǎn)，已成為化學(xué)、醫藥工業(yè)等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應用。

       一、了解色譜法常用專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)

       1.高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，以下簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC）：

       是指采用高壓輸液泵將規定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入色譜柱內，各組分在柱內被分離，并進(jìn)入檢測器檢測，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。

       2.色譜分析法（Chromatography）：

       簡(jiǎn)稱(chēng)色譜法或層析法，是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法，該法利用某一特定的色譜系統（薄層色譜、高效液相色譜或氣相色譜等系統）進(jìn)行混合物中各組分的分離分析。

       3.固定相：

       在色譜分離中固定不動(dòng)，對樣品產(chǎn)生保留的一相。

       4.流動(dòng)相：

       帶動(dòng)樣品向前移動(dòng)的另一相。

       5.保留時(shí)間(retention time，tR)：

       定義為被分離組分從進(jìn)樣到柱后出現該組分最大響應值時(shí)的時(shí)間，也即從進(jìn)樣到出現某組分色譜峰的頂點(diǎn)時(shí)為止所經(jīng)歷的時(shí)間，常以分鐘(min)為時(shí)間單位，用于反映被分離的組分在性質(zhì)上的差異。

       二、常見(jiàn)的HPLC色譜柱，你知道幾種？

       在藥品檢測領(lǐng)域，有“四大名譜”，它們分別為色譜、光譜、質(zhì)譜、波譜，可以說(shuō)只要有分析任務(wù)的地方都在使用色譜分析法，《0512高效液相色譜法》收載的常用的HPLC色譜柱種類(lèi)，分別是：

       1)反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見(jiàn)的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。

       2)正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見(jiàn)的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。

       3)離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽(yáng)離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

       4)手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。

       三、新舊0512高效液相色譜法主要內容搶先看

       根據2020年版《中國藥典》實(shí)施以來(lái)的反饋意見(jiàn)，結合各國藥典色譜法通則的修訂變化，此次有以下幾項內容有發(fā)生變化，紅色字體為刪除內容，藍色字體為增訂內容變更主要內容對照如下：

       1．進(jìn)一步完善色譜參數調整范圍。

       （4）色譜參數調整品種正文項下規定的色譜條件（參數），除填充劑種類(lèi)、流動(dòng)相組分、檢測器類(lèi)型不得改變外，其余如色譜柱內徑與長(cháng)度、填充劑粒徑、流動(dòng)相流速、流動(dòng)相組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器靈敏度等，均可適當調整。

       若需使用小粒徑（約2μm）填充劑和小內徑（約2.1mm）色譜柱或表面多孔填充劑以提高分離度或縮短分析時(shí)間，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配，必要時(shí)，色譜條件（參數）可適當調整。

       色譜參數允許調整范圍見(jiàn)表。

表一色譜參數允許調整的范圍

       表 允許調整的色譜參數及范圍

       注：F1為調整前原規定流速；F2為調整后流速；dc1為調整前原規定色譜柱的內徑；dc2為調整后色譜柱的內徑；dp1為調整前原規定色譜柱的粒徑；dp2為調整后色譜柱的粒徑；Vinj1為調整前原規定進(jìn)樣體積；Vinj2為調整后進(jìn)樣體積；L1為調整前原規定色譜柱柱長(cháng)；L2為調整后色譜柱柱長(cháng)；tR為峰保留時(shí)間；Wh/2為峰半高峰寬。

       2．增加滯留體積對梯度分離影響的描述。

       可通過(guò)相關(guān)軟件計算表中流速、進(jìn)樣體積和梯度洗脫程序的調整范圍，并根據色譜峰分離情況進(jìn)行微調。

       調整后，系統適用性應符合要求，且色譜峰出峰順序不變。通常，較小的填充劑粒徑需增加線(xiàn)速度，較大的填充劑粒徑需降低線(xiàn)速度，在按上表調整流速時(shí)，要注意儀器的壓力限值。若減小進(jìn)樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進(jìn)樣體積，應使分離度和線(xiàn)性關(guān)系仍滿(mǎn)足要求。

       對于梯度洗脫，柱尺寸（柱長(cháng)和柱內徑）改變導致柱體積改變，會(huì )影響控制選擇性的梯度洗脫體積?？赏ㄟ^(guò)調整梯度洗脫體積使其與柱體積成比例。由于梯度洗脫體積是梯度時(shí)間（tG）和流速F的乘積，因此需要對每個(gè)梯度段的梯度時(shí)間進(jìn)行調整，以保持梯度洗脫體積與柱體積的比值恒定（表示為L(cháng)×dc2）。由原來(lái)的梯度時(shí)間（tG1）、流速、柱長(cháng)和柱內徑，按下式計算新的梯度時(shí)間（tG2）。

       tG2=tG1×(F1/F2)×[(L2×dc)/(L1×dc)]

       梯度洗脫條件的調整可分步進(jìn)行：（1）根據L/dp調整柱長(cháng)和粒徑；（2）根據粒徑大小和柱內徑的變化調整流速；（3）根據柱長(cháng)、柱內徑和流速的變化，調整每個(gè)梯度段的梯度時(shí)間。

       若減小進(jìn)樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進(jìn)樣體積，應使分離度和線(xiàn)性關(guān)系仍滿(mǎn)足要求。應評價(jià)色譜參數調整對分離和檢測的影響，必要時(shí)對調整色譜參數后的方法進(jìn)行確認。若調整超出表中規定的范圍或品種項下規定的范圍，被認為是對方法的修改，需要進(jìn)行充分的方法學(xué)驗證。

       調整梯度洗脫色譜參數時(shí)應比調整等度洗脫色譜參數時(shí)更加謹慎，因為此調整可能會(huì )使某些峰位置變化，造成峰識別錯誤，或者與其他峰重疊。如梯度微調后仍不能滿(mǎn)足系統適用性要求，通常應考慮滯留體積的緣故或更換色譜柱。

       滯留體積（dwell volume，用D或VD表示)，也稱(chēng)為梯度延遲體積，是指從流動(dòng)相混合點(diǎn)至柱入口之間的體積。梯度洗脫時(shí)，所采用設備的配置可顯著(zhù)地影響方法所述的分離度、保留時(shí)間和相對保留時(shí)間。如果發(fā)生這種情況，可歸因于過(guò)大的滯留體積。因此，應考慮方法開(kāi)發(fā)時(shí)的系統與實(shí)際使用系統之間滯留體積的差異，在開(kāi)始梯度程序前增加一個(gè)等度平衡階段，通過(guò)調整等度階段時(shí)間來(lái)調整梯度時(shí)間點(diǎn)，以與所使用的分析設備相適應。如在品種項下給出了方法開(kāi)發(fā)時(shí)所

       用的滯留體積，則原梯度表中所述的時(shí)間點(diǎn)（t，min）可用按下式計算的調整后時(shí)間點(diǎn)（tc，min）代替：

       t_c=t- 

       式中D為實(shí)際使用的分析設備的滯留體積（ml）；

       D₀為方法開(kāi)發(fā)時(shí)分析設備的滯留體積（ml）；

       F為流速（ml/min）。

       如驗證證明分析方法應用時(shí)不需等度平衡，則可省略這一等度階段。

       應評價(jià)色譜參數調整對分離和檢測效果的影響，必要時(shí)對調整色譜參數后的方法進(jìn)行確認。多個(gè)參數的調整將對系統性能產(chǎn)生累積影響，需要作適當的風(fēng)險評估。

       對于組分或基質(zhì)特別復雜的體系，如中藥分析方法，進(jìn)行其色譜參數調整時(shí)應特別謹慎。

       若調整超出表中規定的范圍或品種項下規定的范圍，被認為是對方法的修改，需要進(jìn)行充分的方法學(xué)驗證。

       3．在第一節增加（5）溶液制備的描述。

       （5）溶液制備 為減少溶劑峰和色譜峰的畸變，制備供試品溶液和參比物質(zhì)溶液可用流動(dòng)相（或梯度起始比例流動(dòng)相組成）作為溶劑；為提高供試品中待測成分與參比物質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積響應的一致性，制備供試品溶液和參比物質(zhì)溶液的溶劑組成盡可能保持一致。如供試品和/或參比物質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解性不夠，可先用流動(dòng)相組成中具溶解能力的某一溶劑或其它適宜溶劑制備供試品溶液或/和參比物質(zhì)溶液貯備液，再用流動(dòng)相（或梯度起始比例流動(dòng)相組成）稀釋到測試的濃度。

       在測試序列中，應取制備溶液的溶劑和/或稀釋劑進(jìn)樣以確認其是否對待測物質(zhì)峰有干擾。

       對于含量測定，單點(diǎn)對照法定量用供試品溶液與對照品溶液濃度應相同或相近，確保在分析方法線(xiàn)性范圍內，并有足夠的精密度。

       對于限度檢測，如有關(guān)物質(zhì)檢測，除另有規定外，供試品溶液濃度應保證能準確檢測0.1%的雜質(zhì)，對照溶液或對照品溶液濃度應與所關(guān)注的限度濃度相當。

       4．對系統適用性試驗進(jìn)行修訂和補充：

       a.明確分離度（Rs）應以半高峰寬（Wh/2）的計算結果為準。

       （2）分離度（Rs）......無(wú)論是定性鑒別分析還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內標物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對照色譜峰及其他雜質(zhì)色譜峰之間有較好的分離度。除另有規定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應不小于1.5。分離度的計算公式為：

       式中tR2為相鄰兩色譜峰中后一峰的保留時(shí)間；

       tR1為相鄰兩色譜峰中前一峰的保留時(shí)間；

       W1、W2及Wh/2,1、Wh/2,2分別為此相鄰兩色譜峰的峰寬及半高峰寬，見(jiàn)下圖。

       當對測定結果有異議時(shí)，色譜柱的理論板數（n）和分離度（Rs）均應以峰寬 （W）半高峰寬（Wh/2）的計算結果為準。

       b.增加峰谷比（p/v）作為系統適用性的參數。

       （3）峰谷比若待測物質(zhì)峰與相鄰峰之間未達到基線(xiàn)分離，如在有關(guān)物質(zhì)檢測時(shí)，峰谷比（p/v）可作為系統適用性試驗參數。下圖表示部分分離兩個(gè)色譜峰的示意圖，峰谷比值計算公式為：

       式中Hp為小峰平行外推基線(xiàn)的高度

       H為小峰和大峰間曲線(xiàn)最低點(diǎn)平行外推基線(xiàn)的高度。

       峰谷比值計算示意圖

       c.定義靈敏度，修訂信噪比（S/N）計算公式。

       （4）靈敏度用于評價(jià)色譜系統檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比 （S/N）來(lái)表示。建立方法時(shí)，可通過(guò)測定一系列不同濃度的供試品或對照品溶液來(lái)測定信噪比。定量測定時(shí)，信噪比應不小于10；定性測定時(shí)，信噪比應不小于3。系統適用性試驗中可以設置靈敏度實(shí)驗溶液來(lái)評價(jià)色譜系統的檢測能力。

       信噪比（S/N）用于定義系統的靈敏度，按下式計算：

       S/N=

       在使用規定的參比溶液獲得的色譜圖中， H為從目標峰最大值到基線(xiàn)信號的峰高，基線(xiàn)外延距離為目標峰半高峰寬的5倍；h距離為在目標峰5倍寬范圍內觀(guān)察到的最大和最小噪聲的幅度，見(jiàn)下圖。如可能，應平均分布在目標峰的兩側。

       通常，定量限的信噪比應不小于10，檢測限的信噪比應不小于3。系統適用性試驗中可以設置靈敏度試驗溶液來(lái)評價(jià)色譜系統檢測低含量成分的能力。

       d.重新對拖尾因子（T）作出規定。

       （4）（5）拖尾因子（T）

       除另有規定外，在檢查和含量測定項下，以峰面積作定量參數時(shí)，T值應在0.8～1.8之間；以峰高作定量參數時(shí)，除另有規定外，T值應在0.95～1.05之間。

       以峰面積作定量參數時(shí)，一般的峰拖尾或前伸不會(huì )影響峰面積積分，但嚴重拖尾會(huì )影響基線(xiàn)和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準確性，此時(shí)應在品種正文項下對拖尾因子作出予以規定。

       e.修訂對重復性的要求。

       （6）重復性 用于評價(jià)色譜系統連續進(jìn)樣時(shí)響應值的重復性能。除另 有規定外， 通常取各品種項下的對照品溶液或其它溶液，連續重復進(jìn)樣 5 次， 其 峰面積響應測量值（或內標比值或其校正因子）的相對標準偏差應不大于 2.0% ， 如品種項下規定相對標準偏差大于 2.0% ，則以重復進(jìn)樣 6 次的數據計算。視進(jìn) 樣溶液的濃度和/或體積、色譜峰響應和分析方法所能達到的精度水平等， 以滿(mǎn)足 檢測所需的精密度要求為前提， 對相對標準偏差的要求可適當放寬或收緊，放寬 或收緊的范圍以滿(mǎn)足品種項下檢測需要的精密度要求為準并在品種項下予以規定。

       f.增加保留時(shí)間和相對保留時(shí)間作為評價(jià)系統適用性參數的描述。

       （7）其他參數保留時(shí)間和相對保留時(shí)間常用于評價(jià)系統適用性，如在品種項下列出但未明確為系統適用性要求，它們僅作為一種參考。實(shí)驗得到的相對保留時(shí)間與品種項下規定值間的差異應為多少，沒(méi)有適用的可接受標準。

       g.對于復雜體系，提出可在品種項下附對照圖譜來(lái)評價(jià)系統適用性。

       對于復雜體系，可在品種項下附對照圖譜，通過(guò)供試品圖譜與對照圖譜的比對來(lái)評價(jià)系統適用性。

       上述系統適用性試驗及其可接受標準，根據方法驗證特別是耐用性試驗結果在品種項下描述。如上述的與品種項下描述的系統適用性試驗及其可接受標準不同，則以品種項下描述為準。

       除品種項下描述的任何其他系統適用性試驗及其標準外，不論品種項下描述與否，用于檢查或定量分析時(shí)，重復性試驗應滿(mǎn)足本通則或品種項下的要求。在整個(gè)分析過(guò)程中，色譜系統應滿(mǎn)足系統適用性要求，否則實(shí)驗結果不被接受。

       5．在測定法中增加校準曲線(xiàn)測定法。

       （6）校準曲線(xiàn)法

       對于復雜藥物體系中的成分和/或待測成分量在較大范圍變化的含量測定，可采用標準曲線(xiàn)法。標準曲線(xiàn)法可分為外標法和內標法。

       ①外標校準曲線(xiàn)法：精密稱(chēng)取對照品（或工作對照品）適量，或精密量取對照品儲備液適量，配制成不同濃度的系列溶液，精密量取系列溶液各適量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量峰響應，用峰響應對濃度繪制標準曲線(xiàn)，通過(guò)最小二乘法計算出回歸曲線(xiàn)方程。在相同的色譜條件下，再精密量取供試品溶液適量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分的峰響應，由待測成分的峰響應和回歸曲線(xiàn)方程確定供試品溶液中待測成分的量。

       ②內標校準曲線(xiàn)法：精密稱(chēng)取對照品（或工作對照品）適量，或精密量取對照品儲備液適量，與精密量取的內標溶液混合，配成含等量?jì)葮宋锏牟煌瑵舛却郎y成分的系列溶液，精密量取系列溶液各適量，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量待測成分和內標物的峰響應比值，用峰響應比值對待測成分濃度繪制標準曲線(xiàn)，通過(guò)最小二乘法計算出回歸曲線(xiàn)方程。在相同的色譜條件下，再精密量取加有與對照品系列溶液相同量?jì)葮宋锏墓┰嚻啡芤?，進(jìn)樣，記錄色譜圖，測量供試品溶液中待測成分和內標物的色譜峰響應比值，由待測成分的峰響應比值和回歸曲線(xiàn)方程確定供試品溶液中待測成分的量。

       如適用，也可使用其他方法如標準加入法、內插法等，并在品種正文項下注明。

       參考文獻

       [1]www.chp.org.cn