肽核酸（PNA，Peptide Nucleic Acid）是一種人工合成的類(lèi)似于DNA或RNA的聚合物。PNA可以說(shuō)是誕生在丹麥的化合物，它最初由 Peter E. Nielsen（哥本哈根大學(xué)）、Michael Egholm（哥本哈根大學(xué)）、Rolf H. Berg（Risø 國家實(shí)驗室，丹麥科技大學(xué)）和 Ole Buchardt（哥本哈根大學(xué)）于 1991 年發(fā)明。

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PNA的化學(xué)結構

       DNA 和 RNA 的分子骨架是由交替的核糖（脫氧核糖）和磷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接在一起的。與核酸不同，PNA的主鏈是由重復 N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元（圖1）通過(guò)肽鍵（酰胺鍵）搭建而成的（圖2 藍色部分）。相同的是，它們都包含有側鏈的核堿基（nucleobase）。在PNA分子中，各種嘌呤和嘧啶堿基（圖2紅色部分）通過(guò)乙酰結構（圖2綠色部分）與主鏈上甘氨酸部分的N融合。

       可以說(shuō)PNA結合了兩個(gè)截然不同的大分子特征：肽和核酸。從整體來(lái)看，PNA像是包含堿基側鏈的聚N-(2-氨基乙基)-甘氨酸多肽。

圖1. N-(2-氨基乙基)-甘氨酸化學(xué)結構

       如果堿基序列互補，則PNA可以與 DNA 鏈之間產(chǎn)生結合作用。PNA 側鏈的堿基可以與雙鏈RNA或DNA雙螺旋主溝的堿基之間形成氫鍵，從而與雙鏈 RNA 或 DNA 的外部結合。這種所謂的 Hoogsteen 配對產(chǎn)生了三重螺旋。由于 PNA 的主鏈不包含帶負電的磷酸二酯基團，因此由于缺乏靜電排斥，因此PNA與DNA 鏈之間的結合比 DNA與DNA 鏈之間的結合更強。PNA甚至還可以破壞DNA雙鏈之間的結合，從而插入DNA雙鏈中間。但缺少電荷的事實(shí)也使PNA相當疏水，這使得它很難以溶液形式輸送到體細胞。

圖2. PNA與DNA (單鏈) 化學(xué)結構。

       PNA的化學(xué)修飾

       PNA的特性使得這類(lèi)化合物成為反義藥物的理想選擇，因為PNA可以通過(guò)結合 mRNA 來(lái)抑制蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。從理論上講，PNA 可以比當今開(kāi)發(fā)的大多數反義藥物（通常是 DNA 或 RNA 片段）結合得更牢固。

圖3. γ-PNA化學(xué)結構

       第一代 PNA 不溶于水，因此這些分子很容易在溶液中聚集，并與細胞中的其他生物聚合物產(chǎn)生非特異性結合，從而導致毒性。這一問(wèn)題通過(guò)γ-PNA的分子設計得到了解決。通過(guò)將羥甲基引入PNA主鏈上N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元上的Cγ（圖3）。修飾后的 γ-PNA與DNA 和 RNA 更有效地結合。與未修飾的 PNA相比，γ-PNA 與DNA的結合更加穩定。除此之外，PNA不會(huì )像合成 DNA 或 RNA 那樣被核酸酶和蛋白酶降解，這種特性賦予它們更好的穩定性。除了羥甲基之外，研究人員還在在肽骨架上添加二甘醇側鏈，以此增加 PNA 的結合強度并增加改性PNA的溶解度。這些化學(xué)修飾PNA可以解決PNA候選藥物遞送至靶細胞的問(wèn)題。

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PNA的應用

       PNA的應用包括改變基因表達，可以作為抑制劑和啟動(dòng)子、反基因和反義治療劑、抗癌劑、抗病毒劑、抗菌劑和抗寄生蟲(chóng)劑、生物傳感器的分子工具和探針、DNA 序列檢測和納米技術(shù)。

       基因組編輯

       2022 年 10 月，Neubase將其 PNA 業(yè)務(wù)的重點(diǎn)轉向基因編輯上。Neubase 與一家全球醫療保健公司合作，計劃創(chuàng )建 PNA，旨在編輯三種未公開(kāi)疾病的基因突變。異常的核酸結構是內源性修復的關(guān)鍵，可能發(fā)生在序列特定的條件下。PNA能夠實(shí)現非酶促基因編輯。該方法利用了 Nielson 于 1991 年發(fā)現的 PNA 侵入和撬開(kāi)雙鏈 DNA 分子的能力。通過(guò)在基因組內形成高親和力的異源雙鏈或三鏈體結構，PNA 已被用于糾正多種人類(lèi)疾病相關(guān)突變，且脫靶效應較低。分子設計、化學(xué)修飾和遞送方面的進(jìn)步使 PNA 的系統性體內應用成為可能，從而在臨床前小鼠模型中實(shí)現基因編輯。在 β-地中海貧血模型中，經(jīng)過(guò)治療的動(dòng)物表現出臨床相關(guān)的蛋白質(zhì)恢復和疾病表型改善，表明 PNA 具有治療性應用治療單基因疾病的潛力。

       核酸傳感

       特定核酸序列的檢測在生物醫學(xué)研究和診斷中至關(guān)重要。PNA 獨特的雜交特性和代謝穩定性使其非常適合在復雜的生物環(huán)境甚至整個(gè)細胞中進(jìn)行傳感。 活細胞成像的主要策略之一是使用熒光探針，并在雙鏈體復合物形成時(shí)增加熒光。這一技術(shù)已經(jīng)應用于檢測 KRAS 致癌突變 (SNP)。熒光PNA 探針的用途也已擴展到三鏈體的檢測。

       超分子藥物

       在過(guò)去十年中，許多研究使用 PNA―配體偶聯(lián)物，將其自組裝為更大的結構。已發(fā)現 PNA―配體偶聯(lián)物的組裝體在體內具有活性功能。 例如靶向 αvβ3 整合素（一種在許多癌癥中過(guò)度表達的三聚體受體）的 PNA―配體偶聯(lián)物在寡聚化時(shí)顯示出 100 倍的增強結合，導致小鼠模型中的腫瘤集落減少 50%。PNA 標記的大分子已被用于編程抗體片段 (Fab)，以快速探索雙特異性抗體。

       反義治療劑

       PNA 的代謝穩定性和強結合親和力使其成為反基因治療的可利用工具。PNA 是空間阻滯劑，通過(guò)與起始位點(diǎn)結合來(lái)抑制靶 mRNA 的剪接或翻譯。在 C 末端用四個(gè)賴(lài)氨酸修飾的 PNA分子，被證實(shí)可有效糾正轉基因小鼠的異常剪接，顯示出其作為治療劑的潛力。 在另一項研究中，GPNA（α-胍基修飾PNAs） 成功地用于抑制小鼠模型中 EGFR 的表達，EGFR 是非小細胞肺癌的重要驅動(dòng)因素。

       PNA治療劑

       PNA 的主要候選藥物使用直接的反義方法。韓國制藥公司 OliPass在這方面具有領(lǐng)先優(yōu)勢，其最 先進(jìn)的候選藥物止痛藥 OLP-1002 正在進(jìn)行臨床試驗。Olipass 的 PNA 用含有陽(yáng)離子脂質(zhì)基團的堿基進(jìn)行修飾，可提高穩定性并易于進(jìn)入細胞。這使得它們在低至 10 ng/kg 的劑量下在動(dòng)物模型中具有活性，比現有的反義寡核苷酸低許多數量級。 PNA 可以進(jìn)入細胞核，并與前體 mRNA 相互作用。前體 mRNA 是在剪接酶切除不需要的部分之前，通過(guò)轉錄產(chǎn)生的第一個(gè) mRNA 版本。通過(guò)與這些前體mRNA 分子結合，PNA 從根本上防止剪接酶清理 RNA 代碼，導致 mRNA 無(wú)法正確翻譯，從而阻止蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

       第二家利用 PNA 技術(shù)的公司是總部位于匹茲堡的 Neubase Therapeutics。該公司目前擁有針對三種疾病的 PNA 候選藥物。他們最 先進(jìn)的候選藥物 NT-0200 針對 1 型強直性肌營(yíng)養不良癥，這是一種由錯誤的 RNA 引起的進(jìn)行性肌肉疾病，它會(huì )捕獲關(guān)鍵的剪接蛋白并導致細胞翻譯錯誤。根據 Neubase 的小鼠研究，NT-0200 可恢復廣泛組織的下游蛋白質(zhì)生產(chǎn)。該公司還有一種 PNA 候選藥物，它在轉錄成 mRNA 后靶向亨廷頓基因的重復三核苷酸序列。

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總結

       幾種 PNA 藥物正在進(jìn)行臨床試驗，其他藥物正在開(kāi)發(fā)中。開(kāi)發(fā)可行的 PNA 療法的道路一直很艱難。學(xué)術(shù)界和初創(chuàng )企業(yè)的科學(xué)家們對 PNA 骨架的化學(xué)調整，使分子更容易潛入細胞并更牢固地鎖定 RNA 以沉默基因。在開(kāi)發(fā)這些療法的同時(shí)，化學(xué)家現在能夠利用 PNA 嵌入DNA 螺旋的能力，使其成為基因編輯的理想工具，并成為突破性 CRISPR-Cas9 系統的潛在替代品。盡管 CRISPR 有十年的領(lǐng)先優(yōu)勢，但現在有幾種使用 PNA 的基因編輯方法正在研究開(kāi)發(fā)之中。雖然PNA的技術(shù)目前可以說(shuō)尚未修成正果，但距離它們正式登上醫藥舞臺的時(shí)間應該不會(huì )太遠了。

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