小核酸藥物，是近年來(lái)新藥研發(fā)的重要類(lèi)型之一。雖然，其分支ASO、siRNA正處于高產(chǎn)出階段，但仍存在一些技術(shù)問(wèn)題無(wú)法解決。

       有研究者將目光聚焦到激活機制的saRNA，以期尋求技術(shù)與領(lǐng)域的突破，并已有產(chǎn)品進(jìn)入到臨床開(kāi)發(fā)。

       小核酸藥物「再次出發(fā)」。

       01

       saRNA發(fā)現歷史&技術(shù)特點(diǎn)

       最早提出激活RNA的概念，可追溯到上世紀60年代，有研究者認為存在一類(lèi)只分布于細胞核的RNA，可與受體基因結合，形成序列特異性復合物并誘導相關(guān)基因轉錄對應的RNA。但在當時(shí)并未引起足夠的重視。

       2006年，科學(xué)研究發(fā)現在p21、VEGF等多個(gè)基因的一定距離的轉錄起始點(diǎn)啟動(dòng)子區域設計短雙鏈RNA（dsRNA），可上調相應靶基因的表達，并將這種具有靶向激活靶基因的短核苷酸雙鏈命名為saRNA。

       saRNA，作為一類(lèi)非編碼RNA，結構類(lèi)似于siRNA，但生物學(xué)功能完全相反。siRNA可以分別與AGO1、AGO2、AGO3和AGO4四種蛋白結合以獲得活性，而saRNA只能被特異性地加載到AGO2蛋白行使功能。

       目前接受程度較高的RNAa基因調控模型為：

       1）外源性saRNA被加載到細胞質(zhì)中的AGO2蛋白上；

       2）AGO2蛋白通過(guò)切割和丟棄其中一條RNA鏈，形成一個(gè)活性的AGO2-RNA復合物，并進(jìn)入細胞核；

       3）AGO2-RNA復合物將結合到基因組DNA序列或DNA相連的反義轉錄本序列，進(jìn)一步形成RNA誘導的轉錄激活復合物；

       4）該復合物與hnRNPs、RNAPⅡ和各種轉錄因子結合，誘導靶基因表達。

       圖1 saRNA結構與作用機制

       圖片來(lái)源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023

       02

       saRNA藥物設計

       相較于siRNA，saRNA技術(shù)的開(kāi)發(fā)投入遠不如siRNA廣泛及具商業(yè)化特點(diǎn)的積累，目前有研究者提出如下序列設計原則：

       1）目標序列從靶基因的正義鏈序列上篩選；

       2）saRNA靶點(diǎn)選擇在正義鏈轉錄起始位點(diǎn)上游-1200～-200 bp的區域；

       3）每個(gè)靶點(diǎn)長(cháng)度的堿基數相對固定；

       4）靶點(diǎn)堿基的GC含量在40%～65%范圍內；

       5）不能夠出現連續4個(gè)以上相同的核苷酸；

       6）第19個(gè)堿基是A；第18個(gè)堿基是A或T，最好是A；第七個(gè)堿基最好是T；第20-23個(gè)堿基最好是A或T；

       7）選擇目標序列時(shí)避開(kāi)易受DNA甲基化影響的位點(diǎn)。

       類(lèi)似于siRNA，saRNA同樣可能引發(fā)脫靶效應，即以序列特異性或非序列特異性的方式誘發(fā)非預期的基因活性。為了避免序列特異性脫靶反應，所設計的序列還應該進(jìn)行序列BLAST以避免與人類(lèi)基因組其他核苷酸序列有顯著(zhù)同源性。另外，saRNA結構的修飾被證明可以阻斷脫靶效應，這部分的工作進(jìn)行的相對廣泛。

       圖2 特異性上調抑癌基因表達的saRNA序列

       圖片來(lái)源：DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2019.55.495

       03

       saRNA抗腫瘤特點(diǎn)及主要品種

       saRNA，通過(guò)作用于基因調控序列的特異位點(diǎn)，誘導基因轉錄，這已經(jīng)得到學(xué)者們的普遍認同，并成為新的腫瘤研究熱點(diǎn)。這一點(diǎn)不同于早期的siRNA，以及ASO類(lèi)藥物。

       目前，技術(shù)較成熟的小核酸領(lǐng)域藥物當屬ASO和siRNA，但上述二者的獲批適應癥主要集中于遺傳疾病、罕見(jiàn)病領(lǐng)域，眾多已上市品種中，無(wú)腫瘤適應癥獲批。而saRNA開(kāi)發(fā)的起點(diǎn)，即以腫瘤領(lǐng)域為主，這大不相同于“傳統”小核酸藥物，這也是其受關(guān)注的重點(diǎn)原因之一。如p21、p53等腫瘤領(lǐng)域著(zhù)名靶基因及靶點(diǎn)，均為saRNA開(kāi)發(fā)的方向內容。

       圖3 激活寡核苷酸靶向腫瘤抑癌基因

       圖片來(lái)源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023

       但由于saRNA藥物開(kāi)發(fā)仍處于早期階段，目前進(jìn)入臨床的品種并不多。最 具代表性的saRNA產(chǎn)品當屬MTL-CEBPA，臨床用于肝癌的治療，目前最高臨床階段為II期。

       據文獻報道，CEBPA是一種轉錄因子，可調節肝臟穩態(tài)，CEBPA表達下調與多種致癌過(guò)程有關(guān)。研究者將小鼠結腸癌細胞系CT26注射到對抗PD-1治療敏感的小鼠中用以構建小鼠結直腸癌模型，然后注射MTL-CEBPA和PD-1抑制劑。MTL-CEBPA或PD-1抑制劑單獨處理的動(dòng)物腫瘤體積差異并無(wú)統計學(xué)意義，而同時(shí)注射PD-1抑制劑和MTL-CEBPA組的腫瘤體積明顯小于對照組，說(shuō)明MTL-CEBPA和PD-1抑制劑具有協(xié)同作用，且同時(shí)注射PD-1抑制劑和MTL-CEBPA的腫瘤組織CEBPA mRNA表達量更高（8.69倍，P＜0.0001）。

       另，同樣可重點(diǎn)關(guān)注的品種還有我國國內開(kāi)發(fā)的RAG-01，處于臨床I期，是一款首 創(chuàng )作用機制的特異性靶向激活腫瘤抑制基因p21的雙鏈saRNA藥物，通過(guò)RNAa機制激活p21基因的表達，以抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡和衰老。臨床前藥效研究表明，通過(guò)開(kāi)發(fā)公司的小核酸遞送系統，RAG-01的治療能夠顯著(zhù)抑制動(dòng)物模型中膀胱癌腫瘤的生長(cháng)，并展示充分的安全性。

       圖4 全球范圍開(kāi)發(fā)的saRNA相關(guān)腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)展（文獻舉例）

       圖片來(lái)源：Molecular Therapy:Nucleic Acids Vol.31 March 2023

       04

       saRNA技術(shù)布局公司

       當前，基于saRNA技術(shù)進(jìn)入臨床的產(chǎn)品極少，從而對應的開(kāi)發(fā)公司也相對不多。

       如上所述的MTL-CEBPA，原研單位為T(mén)he University of Texas Southwestern Medical Center，其在藥物研發(fā)領(lǐng)域的布局較廣，技術(shù)類(lèi)型涉及小分子化藥、aav產(chǎn)品、RNA產(chǎn)品等，疾病領(lǐng)域集中于腫瘤和神經(jīng)系統。另，MiNA Therapeutics公司的pipeline對MTL-CEBPA相關(guān)信息進(jìn)行了重點(diǎn)介紹，具體如該品種的AACR年會(huì )公開(kāi)信息、臨床Ib期對實(shí)體瘤的聯(lián)合治療、單藥用于肝癌治療的I期臨床等。

       圖5 MiNA Therapeutics聚焦的疾病領(lǐng)域與開(kāi)發(fā)項目

       圖片來(lái)源：https://minatx.com/pipeline/#section_three

       值得一提的是，RAG-01的開(kāi)發(fā)公司中美瑞康，其技術(shù)重點(diǎn)布局于saRNA，在國內以及國外均處于領(lǐng)先地位。

       其研發(fā)管線(xiàn)聚焦于目前尚無(wú)靶向治療藥物的疾病，包括單基因遺傳?。ɡ缁蛲蛔儗е碌膯伪扼w劑量不足）。對于這些疾病，RNA激活通過(guò)增強轉錄來(lái)補償或消除基因活性的損失。借助于全球領(lǐng)先的SCAD™，LiCO™，和GLORY™遞送平臺技術(shù)，中美瑞康布局了多樣化的管線(xiàn)項目，涵蓋中樞神經(jīng)系統、神經(jīng)肌肉、眼科、肝臟和腫瘤等疾病治療領(lǐng)域。

       圖6 中美瑞康-pipeline

       圖片來(lái)源：https://cn.ractigen.com/pipeline/

       05

       結語(yǔ)

       新技術(shù)的開(kāi)發(fā)與推進(jìn)，是新藥領(lǐng)域前進(jìn)的要素之一，saRNA無(wú)疑滿(mǎn)足這一點(diǎn)，尤其是從基因治療的角度來(lái)看。

       RNA激活技術(shù)在存在較大潛力的同時(shí)，同樣存在著(zhù)諸多問(wèn)題，如不成熟的激活序列篩選、穩定性較差的人工合成saRNA、目標基因的激活效果不佳、不同細胞調控方式的差異性、很難滿(mǎn)足腫瘤組織長(cháng)周期的抑制作用等等。

       但上述存在的技術(shù)問(wèn)題很難阻止saRNA的開(kāi)發(fā)與發(fā)展，且已有顯著(zhù)的研究成果產(chǎn)生，并獲得資本方的認可。未來(lái)幾年，該領(lǐng)域很大可能會(huì )快速產(chǎn)出部分產(chǎn)品，但更期待的無(wú)疑是最終的臨床數據。