Nature子刊：清華大學(xué)藍勛/李寅青/朱明團隊開(kāi)發(fā)通用型基因編輯脫靶檢測技術(shù)
近年來(lái)，隨著(zhù)諸如胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和先導編輯器?（prime editor, PE）等新型基因編輯工具不斷被開(kāi)發(fā)，CRISPR-Cas系統引領(lǐng)的基因編輯技術(shù)在眾多領(lǐng)域展現了巨大的應用潛力。然而，脫靶效應——即在預期目標之外產(chǎn)生的編輯——不僅影響了生物學(xué)研究的準確性，也給基因治療的臨床應用帶來(lái)了潛在的安全隱患。2023年美國FDA在審查首個(gè)CRISPR基因編輯療法的上市申請時(shí)，風(fēng)險評估，尤其是脫靶效應是其關(guān)注焦點(diǎn)。高效且精準地檢測脫靶效應成為了基因編輯技術(shù)的關(guān)鍵挑戰之一。
近年來(lái)，隨著(zhù)諸如胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和先導編輯器 （prime editor, PE）等新型基因編輯工具不斷被開(kāi)發(fā)，CRISPR-Cas系統引領(lǐng)的基因編輯技術(shù)在眾多領(lǐng)域展現了巨大的應用潛力。然而，脫靶效應——即在預期目標之外產(chǎn)生的編輯——不僅影響了生物學(xué)研究的準確性，也給基因治療的臨床應用帶來(lái)了潛在的安全隱患。2023年美國FDA在審查首個(gè)CRISPR基因編輯療法的上市申請時(shí)，風(fēng)險評估，尤其是脫靶效應是其關(guān)注焦點(diǎn)。高效且精準地檢測脫靶效應成為了基因編輯技術(shù)的關(guān)鍵挑戰之一。
為應對脫靶挑戰，科學(xué)界提出了多種檢測方法，包括基于生物信息學(xué)的預測、生物化學(xué)檢測和細胞水平檢測方法。然而現存方法普適性較低，或僅針對有限的編輯系統或細胞類(lèi)型設計，并且大多數方法無(wú)法應用于離體及體內編輯時(shí)的脫靶檢測。
2024年7月2日17時(shí)，清華大學(xué)醫學(xué)院藍勛團隊與藥學(xué)院李寅青團隊合作，在 Nature Biotechnology 期刊上發(fā)表了題為：Tracking-seq reveals the heterogeneity of off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome editing 的研究論文。
該研究報道了一項名為Tracking-seq的新型脫靶效應檢測技術(shù)，并借助該技術(shù)揭示了不同細胞類(lèi)型、不同編輯工具間存在的脫靶效應異質(zhì)性。該研究將為基因編輯在基因治療等領(lǐng)域的安全應用提供重要理論參考及技術(shù)支持。
目前的主流基因編輯器均依賴(lài)于DNA損傷后的修復過(guò)程實(shí)現基因編輯，復制蛋白A（replication protein A，RPA）廣泛存在于基因組雙鏈及單鏈損傷修復過(guò)程，Tracking-seq通過(guò)CUT&RUN技術(shù)特異性地識別并捕獲與RPA結合的單鏈DNA（Single-stranded DNA，ssDNA），隨后利用鏈特異性核酸酶消化雙鏈DNA以提高信噪比，構建鏈特異性ssDNA文庫進(jìn)行高通量測序，并通過(guò)新開(kāi)發(fā)的算法精確計算RPA信號強度，進(jìn)而實(shí)現對多種編輯工具的脫靶檢測。
圖1. Tracking-seq示意圖
相較于現有的GUIDE-seq和DISCOVER-seq等脫靶檢測技術(shù)，Tracking-seq不僅展現了高召回率，而且具備很高的檢測精確度。重要的是，其具有高度的泛用性，使其能夠適用于Cas9、CBE、ABE以及PE等各類(lèi)主流基因編輯工具，并能適應不同的細胞類(lèi)型及不同的編輯環(huán)境（包括體外、離體及體內編輯）。此外，Tracking-seq的高靈敏度使其能夠在僅有數千個(gè)細胞的樣品中，有效地進(jìn)行脫靶檢測，并保持優(yōu)異的結果。
圖2. Tracking-seq檢測不同編輯工具的鏈特異性信號
得益于Tracking-seq的高泛用性，該研究發(fā)現當使用相同的向導RNA時(shí)，Cas9、CBE、ABE和PE的脫靶效應存在明顯差異，其中Cas9和CBE之間觀(guān)測到了許多近似于各自特異的脫靶位點(diǎn)。此外，不同類(lèi)型的細胞中也觀(guān)察到了脫靶效應的異質(zhì)性，脫靶事件似乎更容易在染色質(zhì)開(kāi)放和活躍的區域發(fā)生。這些脫靶效應的異質(zhì)性提示，使用替代性編輯系統或在不同細胞類(lèi)型中進(jìn)行的脫靶檢測，可能無(wú)法準確反映目標細胞中實(shí)際的脫靶情況。相比之下，Tracking-seq技術(shù)能夠直接對原始編輯系統進(jìn)行脫靶檢測，因此具有廣闊的應用潛力和前景。
肖女士
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