二甲基亞砜（DMSO）作為一種關(guān)鍵的極性非質(zhì)子溶劑，在室溫條件下呈透明無(wú)色液態(tài)。它不僅在化學(xué)反應中扮演重要角色，也常作為溶劑使用。DMSO的兩親性質(zhì)使其能有效溶解多種小分子疏水性藥物。此外，DMSO還因其卓越的膜滲透性而廣泛應用于細胞和組織的冷凍保護。DMSO能夠改變細胞膜的通透性，促進(jìn)DNA質(zhì)粒的細胞內攝取，從而可能提升蛋白表達水平。

       本研究旨在探索DMSO對HEK-293細胞轉染效率的潛在提升作用。研究將確定DMSO的最佳作用濃度和時(shí)間，以期在不引起細胞毒性的前提下最大化轉染效率。需要注意的是，DMSO在活細胞中的濃度越高或作用時(shí)間越長(cháng)，其細胞毒性可能越大，因為DMSO可能降低細胞膜的剛性，高濃度下甚至可能誘導膜孔的形成。HEK-293細胞系是一種廣泛應用于重組蛋白表達的細胞系，其轉染效率高，翻譯后修飾正確，且蛋白表達速度快，通常在48小時(shí)內達到高峰。對于需要在單細胞水平研究膜蛋白的科研人員來(lái)說(shuō)，提高HEK-293細胞中重組蛋白的表達效率尤為關(guān)鍵。

       本實(shí)驗進(jìn)一步研究了DMSO處理對HEK-293細胞轉染效率和表達量的影響。研究團隊采用GFP作為報告蛋白，通過(guò)測定表達GFP的細胞百分比來(lái)評估轉染效率，并監測DMSO對細胞可能造成的潛在損害。最終，研究選用了磷酸鈣法進(jìn)行HEK-293細胞的瞬時(shí)轉染。盡管市場(chǎng)上有許多基于脂質(zhì)體的轉染試劑，磷酸鈣法依然是一種簡(jiǎn)便、高效且成本低廉的轉染手段，適用于多種貼壁和懸浮細胞的轉染工作。

       結果

       DMSO的作用

       為了探究DMSO對HEK-293細胞中重組蛋白短暫表達的影響，研究團隊首先進(jìn)行了GFP的轉染實(shí)驗。與未處理的對照組相比（見(jiàn)圖1A右側），在細胞轉染后4小時(shí)加入DMSO至培養基中，似乎能夠提升GFP陽(yáng)性細胞的數量（見(jiàn)圖1B右側）。實(shí)驗圖像顯示，與未經(jīng)DMSO處理的培養皿相比，經(jīng)過(guò)DMSO處理的培養皿中觀(guān)察到更多或更亮的GFP陽(yáng)性細胞（見(jiàn)圖1C及其說(shuō)明）。

       在轉染GFP質(zhì)粒后的4小時(shí)內，研究者將DMSO加入到細胞培養中。常規操作中，轉染液被添加到細胞上，隨后培養皿被放回37℃的培養箱中。4小時(shí)后，轉染液被常規生長(cháng)培養基替換。研究者嘗試將DMSO與轉染液預先混合后加入細胞，但發(fā)現這樣做會(huì )導致活細胞數量顯著(zhù)減少，這可能是由于DMSO與細胞共孵育4小時(shí)對細胞產(chǎn)生了毒性。此外，研究者還發(fā)現，將DMSO與轉染液混合會(huì )在混合物中形成沉淀。

       因此，研究者決定在細胞轉染后等待4小時(shí)再進(jìn)行DMSO處理。也就是說(shuō)，在轉染4小時(shí)后，研究者取出轉染的培養皿，首先用PBS進(jìn)行洗滌，然后進(jìn)行DMSO處理。DMSO處理結束后，再次用PBS洗滌培養皿，并在放回培養箱前補充完全生長(cháng)培養基。這一調整后的步驟有助于避免DMSO可能引起的細胞毒性，同時(shí)保持了轉染效率。

圖1:DMSO對HEK-293T細胞中GFP瞬轉表達的影響

       最佳DMSO濃度和賦予時(shí)間的研究

       隨后，研究者著(zhù)手探究用于轉染HEK-293細胞的DMSO處理的最佳濃度和時(shí)間。這一點(diǎn)至關(guān)重要，因為DMSO在較高濃度或長(cháng)時(shí)間作用下可能會(huì )對細胞造成傷害。眾所周知，DMSO即使在較低濃度下，長(cháng)時(shí)間接觸也可能帶來(lái)細胞毒性。為了找到最合適的DMSO濃度，研究者在PBS中對4種不同濃度的DMSO進(jìn)行了測試，這些濃度分別是5%、10%、15%和20%（體積比%；見(jiàn)圖2），處理時(shí)間為5分鐘，同時(shí)設有對照組，即未經(jīng)DMSO處理，僅用PBS緩沖液處理的培養皿。根據圖2A的結果，10%的DMSO處理能夠帶來(lái)更高比例的GFP陽(yáng)性細胞。與此相對，5% DMSO并未相較于對照組顯著(zhù)增加GFP陽(yáng)性細胞的數量。而更高濃度的DMSO處理則導致GFP陽(yáng)性細胞數量顯著(zhù)下降。在10% DMSO濃度下，研究者還觀(guān)察到亮度最高的GFP陽(yáng)性細胞百分比最高。

       在確定了10%為最佳DMSO濃度后，研究者接著(zhù)測試了不同的處理時(shí)間，從2分鐘到15分鐘不等，以10% DMSO溶液在室溫下孵育細胞。結果顯示，大約5分鐘的孵育時(shí)間最為理想（見(jiàn)圖2B）。與對照組相比，較短的孵育時(shí)間（如2分鐘）對GFP陽(yáng)性細胞數量的影響不大。而當DMSO孵育時(shí)間超過(guò)5分鐘后，GFP陽(yáng)性細胞數量有所下降。綜合圖1和圖2的實(shí)驗結果，研究者得出結論，10% DMSO溶液對轉染細胞進(jìn)行5分鐘的孵育是最佳方案。

圖2：確定DMSO的最佳濃度和孵育時(shí)間

       DMSO孵育后GFP表達隨時(shí)間的變化

       接著(zhù)，研究者對經(jīng)DMSO處理的培養皿中GFP表達水平隨時(shí)間的變化進(jìn)行了追蹤觀(guān)察。具體而言，他們對DMSO處理組和對照組（未處理）培養皿中6天內表達GFP的細胞百分比進(jìn)行了測定。研究結果顯示，在觀(guān)察期間，DMSO處理組的GFP表達始終高于未處理組（對照組見(jiàn)圖3B，處理組見(jiàn)圖3A）。此外，兩組細胞在培養第2天均達到GFP表達的峰值（見(jiàn)圖3C）。通過(guò)分析第2天的數據，研究者發(fā)現，在轉染后4小時(shí)采用5% DMSO進(jìn)行5分鐘處理的培養皿中，表達GFP的細胞平均增加了約1.6倍。

       從第3天起，兩組細胞培養液的總體熒光強度開(kāi)始逐步下降（見(jiàn)圖3C）。研究者還發(fā)現，在33℃的較低溫度下培養細胞，與37℃標準培養溫度相比，低溫環(huán)境有助于保持更多的細胞存活。實(shí)際上，未處理的細胞在第2天后也表現出類(lèi)似的下降趨勢（見(jiàn)圖3C），這與研究者之前對常規HEK-293細胞培養條件（無(wú)DMSO處理）的觀(guān)察相符，進(jìn)一步證實(shí)了短時(shí)間DMSO孵育（5分鐘）對轉染后的HEK-293細胞狀態(tài)的影響微乎其微。

       綜合分析，從第2天起綠色細胞百分比的下降可能主要是由于蛋白質(zhì)的內在降解和/或細胞的裂解。有研究指出，GFP在哺乳動(dòng)物細胞中的半衰期大約為26小時(shí)。在哺乳動(dòng)物細胞（如HEK-293細胞）中進(jìn)行重組蛋白的瞬時(shí)轉染時(shí)，通常選擇在轉染后24至72小時(shí)內收集細胞，因為這個(gè)時(shí)間段內蛋白質(zhì)的表達量最高。研究者所觀(guān)察到的現象（見(jiàn)圖3）正符合這一時(shí)間窗口。

圖3：DMSO孵育后GFP表達的時(shí)間過(guò)程

       結論

       短暫轉染的哺乳動(dòng)物細胞培養物表達重組蛋白的生產(chǎn)力取決于多種因素。這些因素包括宿主細胞類(lèi)型、基因轉錄和翻譯速率、基因表達的穩定性、細胞中的翻譯后修飾以及轉染效率。一旦選擇了細胞來(lái)源或細胞系，操縱轉染效率可能是提高基因產(chǎn)物產(chǎn)量最有效的方法之一。使HEK-293細胞成為短暫基因表達系統的一個(gè)吸引人的選擇的各種屬性之一是這些細胞可以很容易地被操縱?；谶@一理念，我們研究了，并在這里報告，短暫暴露DMSO對轉染細胞的生產(chǎn)力對短暫表達產(chǎn)量的影響。正如我們在這項研究中所展示的，將10% DMSO暴露于4小時(shí)后轉染感興趣重組蛋白的HEK-293細胞，可以提高表達產(chǎn)量約1.6倍，而對細胞的活性或生長(cháng)沒(méi)有任何負面影響。

       我們研究中的一個(gè)重要發(fā)現是，DMSO對細胞的暴露應該在細胞已經(jīng)暴露于轉染試劑后4小時(shí)發(fā)生；在我們的例子中，我們使用了鈣磷酸鹽DNA共沉淀。在這種情況下，認為與細胞的轉染混合物4小時(shí)孵化足以允許吸收細胞表面的外來(lái)DNA。這是我們通常會(huì )用完整培養基替換轉染溶液，然后將轉染培養物放回孵化器的時(shí)間。因此，用DMSO處理培養物5分鐘只是完整培養基交換之前的一個(gè)額外步驟。然而，應注意，在DMSO處理后進(jìn)行培養基替換期間，因為經(jīng)過(guò)DMSO處理的細胞容易在培養基交換時(shí)被沖走。如果一個(gè)人希望收獲整個(gè)培養物而不僅僅是使用一小部分細胞進(jìn)行電生理學(xué)研究，這一點(diǎn)將特別重要。關(guān)于這一點(diǎn)，我們還最初嘗試使用相同的協(xié)議，即5分鐘10% DMSO處理，使用懸浮適應的HEK-293S細胞。我們發(fā)現在HEK-293S細胞中也有類(lèi)似的增強，但是培養皿必須首先涂覆膠原蛋白；否則在去除DMSO溶液并清洗培養皿之前，會(huì )有大量的細胞丟失。顯然，通過(guò)移液管將DMSO溶液從培養皿中分離出來(lái)是適合靜態(tài)培養的?？偟膩?lái)說(shuō)，我們描述的方法很容易實(shí)施，考慮到鈣磷酸鹽DNA共沉淀協(xié)議是將外來(lái)基因引入哺乳動(dòng)物細胞的一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟的方式。實(shí)際上，自從Graham和Van der Eb在1973年報道這種方法用于轉染腺病毒DNA和猴病毒40進(jìn)入哺乳動(dòng)物細胞以來(lái)，鈣磷酸鹽轉染一直是引入基因的流行的方法之一。

       對轉染的HEK-293細胞使用10% DMSO進(jìn)行5分鐘處理，由此增加了約1.6倍的轉染效率，這一效果很可能歸因于DMSO分子提高膜滲透性的能力，通過(guò)滲透作用以及DMSO誘導的膜上磷脂頭基的脫水作用。因此，更多的cDNA質(zhì)粒能夠進(jìn)入細胞，或者通過(guò)內吞作用準確地被細胞攝取，并最終進(jìn)入細胞核。然而，更高濃度的DMSO或更長(cháng)時(shí)間的DMSO暴露具有細胞毒性。即使是較低濃度的DMSO，但長(cháng)時(shí)間暴露或極端情況下，長(cháng)期將DMSO培養在培養基中，也可能對細胞造成傷害。在這項研究中，我們展示了盡管將同一DMSO濃度（即10%）的暴露時(shí)間從5分鐘延長(cháng)到10分鐘，并不會(huì )導致細胞計數降低，至少不會(huì )顯著(zhù)降低，但它確實(shí)導致了蛋白表達百分比的降低，正如GFP實(shí)驗中所見(jiàn)。在這種情況下，蛋白質(zhì)產(chǎn)量的減少，而不是細胞數量，可能歸因于DMSO處理對轉錄的負面影響。DMSO的過(guò)度暴露可能會(huì )抑制細胞核糖體的功能。只要將暴露時(shí)間保持簡(jiǎn)短或精確地5分鐘，這樣的程序就可以在不損害細胞活性、細胞生長(cháng)或在HEK-293細胞中表達的蛋白質(zhì)的功能屬性的情況下，產(chǎn)生更高的短暫轉染產(chǎn)量。