嵌合性抗原受體（Chimeric antigen receptor，CAR）是一種人工合成的免疫受體，整合了抗體的抗原識別區，T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）的信號區，以及共刺激分子的信號區。利用基因工程方法在T細胞中外源表達CAR后，產(chǎn)生的CAR-T細胞可以針對特定抗原產(chǎn)生免疫應答反應。CAR-T細胞治療已經(jīng)獲批用于治療腫瘤，在自身免疫病中也展示了很好的應用前景，未來(lái)還可以用于感染、器官纖維化、衰老等多種場(chǎng)景。
與天然的受體TCR相比，CAR的抗原敏感性差，并且與其它信號分子的協(xié)同性差。這些劣勢是因為CAR無(wú)法像TCR一樣形成成熟的免疫突觸來(lái)整合各條信號通路。這些信號的劣勢會(huì )導致CAR-T細胞無(wú)法清除抗原表達量低的靶細胞，并且容易發(fā)生功能耗竭，難以長(cháng)期工作。優(yōu)化CAR的信號轉導功能是突破目前CAR-T細胞治療臨床瓶頸的關(guān)鍵所在。
2024年11月27日，中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng )新中心（生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所）許琛琦研究組聯(lián)合上?？萍即髮W(xué)王皞鵬研究組，在 Immunity 期刊發(fā)表了題為：Phase separation of chimeric antigen receptor promotes immunological synapse maturation and persistent cytotoxicity 的研究論文。
該研究在傳統二代CAR分子胞內段引入TCR中的CD3ε元件（E-CAR），并且對CD3ε進(jìn)行了序列優(yōu)化，提高E-CAR在細胞膜上的穩定性。E-CAR分子可以通過(guò)cation-pi相互作用產(chǎn)生液液相分離（LLPS），幫助免疫突觸的形成與成熟；這不僅增強了E-CAR分子本身的信號功能，也能招募CD2等共刺激分子，更好地利用內源共刺激信號。E-CAR-T細胞比普通的CAR-T細胞具有更高的抗原敏感性，以及更好的持續殺傷能力，在初發(fā)腫瘤和復發(fā)腫瘤的動(dòng)物模型中，展示了更好的抗腫瘤功能。目前E-CAR已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段，展示了很好的應用前景。
可相分離的E-CAR促進(jìn)T細胞免疫突觸成熟，從而提高抗原敏感性和細胞長(cháng)效性
大多數T細胞的TCR主要由抗原識別亞基TCRαβ和信號傳遞亞基CD3εδ、CD3εγ、CD3ζζ組成。CD3分子富含多處功能序列，可以結合不同信號分子，發(fā)揮各種調控功能。其中，CD3ε分子的N端是一段堿性氨基酸富集區（Basic amino acid-rich sequence，BRS），緊接著(zhù)是一段脯氨酸富集區（Proline-rich sequence，PRS），C 端則由一段包含RK序列的免疫受體酪氨酸激活基序（Immunoreceptor activation tyrosine-based motif，ITAM）組成。
許琛琦團隊和合作者的前期研究發(fā)現，當T細胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，BRS與細胞質(zhì)膜的酸性磷脂發(fā)生靜電相互作用，將CD3e的胞內區屏蔽在膜內，防止T細胞產(chǎn)生過(guò)強的基底信號（Xu et al., Cell 2008）；抗原刺激TCR后，鈣離子大量?jì)攘?，中和酸性磷脂的負電荷，從而打破BRS和酸性磷脂的靜電相互作用，釋放CD3ε胞內區（Shi et al., Nature 2013）；CD3ε BRS隨后和酪氨酸激酶LCK發(fā)生靜電相互作用，促進(jìn)TCR-LCK的液液相分離，增強TCR的磷酸化，并進(jìn)一步促進(jìn)LCK的活化（Chen et al., PNAS 2023）。磷酸化的CD3ε ITAM可以招募抑制性激酶CSK，抑制LCK活性，并打破TCR-LCK相分離，使得TCR信號回歸基線(xiàn)，防止細胞過(guò)度活化（Wu et al., Cell 2020）。
許琛琦團隊進(jìn)而將CD3ε引入二代CAR分子，設計了功能上更加模擬TCR的第一代E-CAR。在該論文中，研究團隊發(fā)現，E-CAR 1.0的胞內信號區自己就能夠形成液液相分離，而傳統二代CAR分子的相分離現象較弱。這種相分離主要由CD3ε的堿性氨基酸和其它信號區上的酪氨酸所帶的pi電子形成的cation-pi相互作用所介導。在細胞水平，E-CAR 1.0更易于在細胞表面聚集，然而E-CAR在膜上的表達水平比傳統CAR低。因此，團隊通過(guò)蛋白序列優(yōu)化，構建了一種E-CAR 2.0版本（B6I），保留了其相分離所需的堿性氨基酸，并有效地提高了膜表達水平。
28Z CAR、E-CAR 1.0、E-CAR 2.0模式圖
T細胞與靶細胞接觸時(shí)形成高度有序的超分子激活簇（Supramolecular activation cluster，SMAC），成熟的TCR免疫突觸通常是具有“牛眼“樣結構，由TCR形成的central SMAC（cSMAC），由黏附分子LFA-1形成的peripheral SMAC（pSMAC）和富含磷酸酶CD45的distal SMAC（dSMAC）。pSMAC和dSMAC之間還有共刺激受體CD2形成的花冠結構，富含CD28、ICOS等多種共刺激分子和PD-1等共抑制受體，共同調控T細胞信號。多層有序的免疫突觸結構確保了信號的有效傳遞。很多研究表明CAR分子不能形成經(jīng)典的免疫突觸結構，CAR分子形成的通常是不規則的微簇結構，這導致其對抗原信號傳遞低效和對共刺激信號利用不足。與TCR相比，傳統CAR分子只利用了CD3ζ鏈作為其主要信號傳遞亞基。其余CD3鏈的缺失可能導致CAR無(wú)法形成成熟的免疫突觸。
由于抗原受體聚集是免疫突觸形成的基礎，E-CAR相分離促進(jìn)了免疫突觸成熟，不僅提升了E-CAR在cSMAC中的信號轉導功能，還在外周形成更好的CD2花冠結構，招募PI3K這些信號分子來(lái)介導共刺激信號。團隊還注意到，E-CAR免疫突觸呈現出信號先放大后減弱的動(dòng)態(tài)性，與TCR形成的免疫突觸非常相似。
團隊接下來(lái)研究了E-CAR-T細胞的功能，發(fā)現其對弱抗原腫瘤細胞的結合與殺傷都更強。通過(guò)建立腫瘤細胞反復刺激模型，團隊發(fā)現E-CAR-T細胞的長(cháng)效殺傷效果更好，在清除腫瘤細胞的同時(shí)還可維持自我增殖。RNA測序結果顯示E-CAR-T細胞可以利用CD2信號來(lái)緩解功能耗竭，這與其能誘導形成CD2花冠結構這一現象吻合。在血液瘤和實(shí)體瘤的初發(fā)腫瘤動(dòng)物模型以及血液瘤復發(fā)的動(dòng)物模型中，E-CAR-T細胞都比傳統的細胞表現出了更好的抗腫瘤效果。
綜上所述，該研究通過(guò)蛋白設計，構建了可相分離的新型E-CAR分子，提高了免疫突觸質(zhì)量，從而提高了抗原敏感性和細胞持續性，在動(dòng)物模型中取得了很好的疾病治療效果。
E-CAR胞內段相分離就像睡蓮的根莖交錯纏繞，吸引來(lái)的各種小魚(yú)意味著(zhù)成熟的免疫突觸招募了各類(lèi)下游信號分子，介導T細胞的免疫應答反應
中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng )新中心許琛琦研究員和上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬研究員為論文共同通訊作者。分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng )新中心博士研究生徐心怡、上?？萍即髮W(xué)與分子細胞中心聯(lián)合培養碩士研究生陳昊天、分子細胞中心博士研究生任正旭、國科大杭州高等研究院碩士研究生徐曉敏為論文共同第一作者。
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