2025年1月13日，中國科學(xué)院生物物理研究所趙巖團隊在 Nature 子刊 Nature Structural & Molecular Biology 發(fā)表了題為：Binding mechanism and antagonism of the vesicular acetylcholine transporter VAChT 的最新研究成果。
該研究通過(guò)冷凍電鏡單顆粒技術(shù)重構出人類(lèi)囊泡乙酰膽堿轉運體（VAChT）在無(wú)底物狀態(tài)下、底物ACh結合狀態(tài)下以及抑制劑vesamicol結合狀態(tài)下的高分辨率結構，闡明了VAChT底物識別和質(zhì)子耦合轉運過(guò)程機制，其抑制劑vesamicol結合結構揭示了vesamicol與VAChT的抑制機制，為設計靶向VAChT的新型示蹤劑提供了結構基礎。
一個(gè)神經(jīng)元的放電（firing）就像一個(gè)火花，點(diǎn)亮了紛繁復雜的神經(jīng)通路，傳遞著(zhù)記憶和行動(dòng)等指令，高效協(xié)調神經(jīng)系統各項功能，從而精準調控我們的想法、情感和動(dòng)作，構建起一個(gè)精細有序的 “神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )世界”。
回溯近一百年神經(jīng)科學(xué)探索，“蛙心灌流”實(shí)驗意義非凡。借助蛙心跳動(dòng)，科學(xué)家首次揭示了神經(jīng)沖動(dòng)與化學(xué)傳遞的關(guān)系。作為人類(lèi)發(fā)現的第一種神經(jīng)遞質(zhì)，隨著(zhù)對乙酰膽堿研究的不斷深入，其生理功能正逐漸變得清晰起來(lái)：在外周神經(jīng)系統中控制肌肉運動(dòng)；在中樞神經(jīng)系統中影響思維、認知和記憶。同時(shí)，膽堿能神經(jīng)元功能異常與多種疾病密切相關(guān)。
以肌無(wú)力綜合癥為例，膽堿能神經(jīng)元或其下游肌肉的運作障礙將逐漸侵蝕患者的日常生活能力：從表情僵硬、吞咽困難，到四肢動(dòng)作受限，最終步態(tài)變得遲緩甚至完全喪失行走能力。在病程后期，由于呼吸肌無(wú)力或心臟等關(guān)鍵器官功能的衰竭，生命因此受到威脅。而在中樞神經(jīng)系統中，膽堿能神經(jīng)元則承擔著(zhù)認知和記憶的重要功能。當這些神經(jīng)元發(fā)生異?；蛑饾u丟失，患者逐漸經(jīng)歷智力衰退、語(yǔ)言障礙和感知力減弱。阿爾茨海默癥、帕金森綜合征的發(fā)生也與膽堿能神經(jīng)元的減少密切相關(guān)。這些不僅凸顯了膽堿能神經(jīng)信號傳遞在生理、病理中扮演者關(guān)鍵角色，也是相關(guān)疾病的診療關(guān)鍵。
“星星之火，可以燎原”，神經(jīng)元的放電需要“火種”的點(diǎn)燃。乙酰膽堿猶如一根根“火柴”，點(diǎn)燃了神經(jīng)與神經(jīng)，神經(jīng)與肌肉之間的信號傳遞，驅動(dòng)思維與肢體精準協(xié)作。乙酰膽堿在突觸間隙完成了信號傳遞過(guò)程之后，被乙酰膽堿酯酶分解為“火柴棍”乙酸和“火柴頭”膽堿。“火柴頭”膽堿是生產(chǎn)乙酰膽堿的“戰略”物資，在高親和力膽堿轉運體（CHT1）的嚴格篩查下運輸送往乙酰膽堿生產(chǎn)線(xiàn)（見(jiàn)圖1）——那么，關(guān)于這樣的篩查和運輸是如何進(jìn)行的？
2024年，中國科學(xué)院生物物理研究所趙巖課題組先后在 Nature Structural & Molecular Biology、Structure 期刊發(fā)表系統性研究，揭示了CHT1偶聯(lián)鈉離子、氯離子攝取膽堿的分子機制，以及與小分子抑制劑的識別機制，為深層次的理解膽堿是如何被攝取進(jìn)膽堿能神經(jīng)元提供了全面的見(jiàn)解。
利用CHT1攝取的膽堿，膽堿能神經(jīng)元中由膽堿乙酰轉移酶合成新的“火柴”乙酰膽堿。隨后，乙酰膽堿會(huì )被送往一個(gè)個(gè)囊泡儲存，為驅動(dòng)下一次信號傳遞做準備。那么，這個(gè)關(guān)鍵環(huán)節是如何發(fā)生的呢？
囊泡乙酰膽堿轉運體（VAChT）作為一種至關(guān)重要的轉運蛋白，猶如一名技術(shù)嫻熟的“打包員”，將乙酰膽堿打包進(jìn)入囊泡（見(jiàn)圖1）。
幾十年來(lái)，研究人員對VAChT已進(jìn)行了廣泛研究，但其選擇性轉運乙酰膽堿的分子機制仍未被完全闡明。此外，膽堿能神經(jīng)元在腦內的豐度變化與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。由于VAChT是膽堿能神經(jīng)元標志性蛋白質(zhì)分子，通過(guò)開(kāi)發(fā)靶向VAChT的分子影像技術(shù)（包括PET和SPECT等）示蹤劑是相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的早期診斷關(guān)鍵策略。目前，部分靶向VAChT的示蹤劑已進(jìn)入臨床II期試驗。然而，這些示蹤劑與VAChT之間的相互作用機制仍未完全明確。
圖1. 膽堿能神經(jīng)元中乙酰膽堿的循環(huán)及信號傳遞過(guò)程
VAChT屬于質(zhì)子/溶質(zhì)逆向轉運蛋白家族，在質(zhì)子電化學(xué)勢的驅動(dòng)下完成底物乙酰膽堿的跨膜轉運。研究團隊分別解析無(wú)底物及乙酰膽堿結合的囊泡開(kāi)口結構（見(jiàn)圖2c），同時(shí)鑒定出獨特的質(zhì)子傳遞網(wǎng)絡(luò )。乙酰膽堿結合在VAChT中央口袋中，通過(guò)與結合口袋周?chē)P(guān)鍵氨基酸形成大量氫鍵和靜電相互作用，從而實(shí)現特異性的結合與轉運。
為了深入理解這些相互作用對轉運功能的影響，研究團隊將與乙酰膽堿及質(zhì)子結合密切相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了突變，并在小鼠大腦背側紋狀體內對膽堿能神經(jīng)元釋放乙酰膽堿的功能進(jìn)行了研究（見(jiàn)圖2a）。紋狀體內乙酰膽堿的釋放對包括運動(dòng)控制、決策行為、學(xué)習和記憶在內的多種生理功能具有重要調節作用。我們發(fā)現相關(guān)的突變會(huì )直接影響乙酰膽堿在紋狀體中的釋放，直觀(guān)地闡釋了質(zhì)子結合、底物轉運與生理功能之間的關(guān)系，為理解VAChT在乙酰膽堿轉運、儲存和釋放中的作用提供了重要見(jiàn)解。
Vesamicol 是特異性結合VAChT的高親和力抑制劑，可以有效的阻斷其轉運活性。Vesamicol的衍生物，如[123I]iodobenzovesamicol（[123I]IBVM）和[18F]fluoroethoxybenzovesamicol（[18F]FEOBV），都已進(jìn)入臨床二期階段，用于檢測膽堿能神經(jīng)系統的數量和完整性，為神經(jīng)退行性疾病的診斷提供關(guān)鍵信息。
為了探究vesamicol結合VAChT的機制，研究團隊成功解析了vesamicol與VAChT結合復合物的高分辨率結構（見(jiàn)圖2c），vesamicol通過(guò)與VAChT的特定結合位點(diǎn)相互作用結合在囊泡側開(kāi)口的口袋中，穩定轉運蛋白在特定構象中，阻止VAChT從囊泡開(kāi)口構象轉變?yōu)榘|(zhì)側開(kāi)口構象，進(jìn)而抑制乙酰膽堿的轉運。此外，通過(guò)放射性抑制劑結合實(shí)驗，進(jìn)一步驗證了參與相互作用和選擇性抑制的關(guān)鍵氨基酸（見(jiàn)圖2b）?？傊?，這項研究加深了對VAChT底物識別和獨特質(zhì)子偶聯(lián)底物轉運機制的認識，為神經(jīng)退行性疾病的示蹤劑開(kāi)發(fā)與優(yōu)化奠定了重要基礎。
圖2：小鼠大腦紋狀體VAChT介導乙酰膽堿囊泡填充的動(dòng)態(tài)檢測、抑制劑vesamicol特異性結合曲線(xiàn)及VAChT在天然狀態(tài)、底物乙酰膽堿結合狀態(tài)以及抑制劑vesamicol結合狀態(tài)下的冷凍電鏡結構
中國科學(xué)院生物物理研究所趙巖研究員為該論文通訊作者，中國科學(xué)院生物物理研究所博士研究生馬喬、中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員馬錕鵬、北京林業(yè)大學(xué)副教授董艷麗、博士研究生孟宇飛和北京大學(xué)現代農業(yè)研究院趙珺研究員為論文共同第一作者。此外，實(shí)驗室成員黎仁杰、白秦儒，中國科學(xué)院物理研究所姜道華研究員、博士研究生武迪和中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院孫堅原研究員也為本研究做出了重要貢獻。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41594-024-01462-9
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