早期胚胎發(fā)育是生命科學(xué)領(lǐng)域的核心研究方向之一。胚胎從受精卵開(kāi)始發(fā)育，經(jīng)過(guò)基因組激活（zygotic genome activation，ZGA）、快速細胞分裂和譜系分化，最終形成囊胚，為胚胎著(zhù)床及后續發(fā)育奠定基礎。在這一過(guò)程中，囊胚內三譜系的形成——內細胞團（inner cell mass，ICM）、原始內胚層（primitive endoderm，PrE）和滋養外胚層（trophectoderm，TE）——標志著(zhù)胚胎命運決定的關(guān)鍵轉折點(diǎn)。然而，受限于胚胎樣本的稀缺性和實(shí)驗條件的限制，如何構建精準模擬早期胚胎發(fā)育的體外系統，仍是該領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)難題。
2021 年，北京大學(xué)、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心杜鵬課題組通過(guò)抑制剪接體，首次捕獲并穩定培養了小鼠全能性干細胞（mouse totipotent blastomere-like cells，mTBLC）。與經(jīng)典的多能性干細胞不同，mTBLC 能夠重現全能性卵裂球的特征，為構建從單細胞開(kāi)始的分化和囊胚形成模型提供了理想的“種子細胞”。隨后，在 2024 年，杜鵬團隊利用相同的策略成功獲得了人類(lèi)全能性干細胞，為進(jìn)一步探索全能性及其在胚胎發(fā)育研究中的應用提供了重要工具。
2025 年 1 月 17 日，杜鵬課題組在 Cell Stem Cell 期刊發(fā)表了題為：Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation 的研究論文。
在這項研究中，研究團隊進(jìn)一步優(yōu)化了 mTBLC 的培養條件，并開(kāi)發(fā)了 mTBLC 自發(fā)分化和單細胞起始的類(lèi)囊胚形成系統，mTBLC-類(lèi)囊胚具有上胚層（EPI）、原始內胚層（PrE）和胚外滋養層（TE）譜系，并能進(jìn)一步形成著(zhù)床后階段的卵圓柱胚樣結構，重現了從 ZGA 至囊胚形成的完整發(fā)育過(guò)程。這一突破為研究全能性、細胞命運決定以及早期胚胎形態(tài)發(fā)生提供了新的技術(shù)平臺，也為早期發(fā)育的基礎與轉化研究開(kāi)辟了新的可能性。
在這項研究工作中，研究團隊主要有以下發(fā)現：
1、該研究通過(guò)優(yōu)化培養基（2MYCP），顯著(zhù)提高了 mTBLC 的增殖速度和長(cháng)期自我更新能力，主要通過(guò)加入 2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021 和 PlaB 等因子。在此過(guò)程中，PlaB 發(fā)揮了關(guān)鍵作用，通過(guò)抑制剪接驅動(dòng)了從多能性向全能性的轉變，而 Oct4 基因的去除并未影響 mTBLC 在 2MYCP 培養基中的自我更新能力，表明 Oct4 不是維持細胞全能性的必要條件。2MYCP 培養基中，Wnt 信號通路在 mTBLC 中被激活，且 Wnt 信號通路與細胞周期、增殖通路的激活與 mTBLC 的快速自我更新能力密切相關(guān)。進(jìn)一步的實(shí)驗結果表明，抑制 Wnt 信號通路可顯著(zhù)抑制 mTBLC 的增殖，證明 Wnt 信號對于 2MYCP 培養基中 mTBLC 的快速擴增至關(guān)重要，但它并不參與維持 mTBLC 的全能性。
2、mTBLC 具有獨特的表觀(guān)基因組特征，這些特征有助于其全能性維持和快速自我更新。通過(guò) ATAC-seq 和 CUT&Tag 分析，發(fā)現 mTBLC 的啟動(dòng)子區域（TSS）H3K27me3 和 H3K9me3 整體水平下降，而 H3K4me3、H3K27ac 和 RNA Pol II 標記整體水平未發(fā)生顯著(zhù)變化，其表觀(guān)特征與早期胚胎的初期胚胎細胞（如2細胞階段）相似。此外，mTBLC 具有比 PSC 更多的寬的 H3K4me3 域 （broad domain），以及更少的二價(jià)修飾基因（bivalent gene），且 MERVL 轉座子在 mTBLC 中具有顯著(zhù)的 H3K4me3 標記。Wnt 信號通路的激活進(jìn)一步增強了與細胞周期和增殖相關(guān)基因的 H3K4me3 富集，從而促進(jìn)了 mTBLC 的快速增殖。
3、該研究進(jìn)一步評估了 mTBLC 在體內外的分化潛力。在嵌合體實(shí)驗中，通過(guò)單細胞數據，捕獲到了 EGFP 標記的 mTBLC 生成的 13 種細胞，其中包括 7 個(gè)胚外譜系和 6 個(gè)胚內譜系，證明了其在嵌合小鼠中的雙向發(fā)育潛能。此外，mTBLC 通過(guò)類(lèi)胚體（EB）和畸胎瘤實(shí)驗也都展示出了胚內外雙向分化潛能，產(chǎn)生了包括神經(jīng)、心臟和腎臟等三胚層來(lái)源的細胞，也激活了包括經(jīng)典滋養層標志基因，展示其能夠生成胚外滋養層樣譜系?？傮w而言，mTBLC 具有強大的雙向發(fā)育潛力，能夠分化為各種胚內外譜系，成為評估全能干細胞發(fā)育潛力的重要工具。
4、該研究利用 mTBLC 建立了一個(gè)模擬胚胎著(zhù)床前發(fā)育的體外分化模型，以克服現有體外分化系統的挑戰。在基礎分化培養基中培養 mTBLC 約 3-4 天后，細胞形態(tài)發(fā)生顯著(zhù)變化，形成了胚胎干細胞（ESC）、胚外內胚層干細胞（XEN）和滋養層干細胞（TSC）樣的克隆。RNA-seq 分析顯示，mTBLC 在分化過(guò)程中激活了不同發(fā)育階段的基因，經(jīng)歷了從早期初級基因組激活（minor ZGA）到主要基因激活（major ZGA）的轉變。免疫組化驗證了 mTBLC 能夠分化為上胚層（EPI）、胚外滋養層（TE）和原始內胚層（PrE）等譜系。單細胞 RNA 測序揭示，mTBLC 在分化過(guò)程中產(chǎn)生了涵蓋 2 細胞、4 細胞、8 細胞及囊胚階段的多種細胞類(lèi)型，擬時(shí)間分析顯示 mTBLC 經(jīng)歷了兩次命運決定，首次產(chǎn)生 TE 樣細胞和 ICM/EPI 樣細胞，隨后 ICM/EPI 樣細胞分化產(chǎn)生了 PrE 樣細胞。
研究進(jìn)一步發(fā)現，在自發(fā)分化過(guò)程中，mTBLC 還產(chǎn)生了 Zscan4+ 和 Zscan4- 兩類(lèi)基因組激活樣細胞（ZLC）。擬時(shí)間分析表明，只有 Zscan4- ZLC 能夠成功分化為 EPI、PrE 和 TE 三大譜系。因此，該研究提出，主要的 ZGA 調控網(wǎng)絡(luò )可能至少可以分為由 Zscan4 表達標記的兩個(gè)獨立部分。同時(shí)，Zscan4 的表達可能并不是進(jìn)一步干細胞命運決定所必需的。這一觀(guān)察結果也與人類(lèi) TBLC 的自發(fā)分化過(guò)程一致，在這一過(guò)程中，經(jīng)典的 ZGA 標志基因（如 ZSCAN4/5A、DUXA/B 和 TPRX1 等）完全沒(méi)有被誘導表達。這些發(fā)現不僅進(jìn)一步證實(shí)了 mTBLC 的內在全能性，也為探索哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過(guò)程中的共性機制提供了新視角。
5、研究還發(fā)現，在沒(méi)有任何外源性信號干預的情況下，單個(gè) mTBLC 能夠經(jīng)歷擴增、極化和壓實(shí)過(guò)程，最終高效率地形成結構完整的類(lèi)囊胚（blastoid）。這一類(lèi)囊胚結構不僅包含內細胞團、原始內胚層和滋養外胚層等胚胎樣細胞，且未見(jiàn)異常中間狀態(tài)的細胞，mTBLC 來(lái)源的囊胚在轉錄組上與體內囊胚更為接近，三個(gè)譜系的特定標志物富集。并且類(lèi)囊胚可以在體外繼續培養，發(fā)育成類(lèi)似卵圓柱的后植入階段結構。也可以將類(lèi)囊胚移植到假孕小鼠中，其成功植入并形成卵圓柱樣著(zhù)床后胚胎結構。
綜上，該研究首次建立了基于 mTBLC 的自發(fā)分化和胚胎樣結構形成系統，成功模擬了胚胎早期發(fā)育的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節。尤其是在細胞命運決定和全能性研究領(lǐng)域，這一系統為理解早期胚胎發(fā)育中的細胞命運轉變提供了新的視角。此外，該研究還為胚胎發(fā)育模型的應用開(kāi)辟了新的可能性，未來(lái)基于這一系統，科學(xué)家們有望深入研究胚胎發(fā)育異常的分子機制，探索病理過(guò)程，甚至為解決不孕不育等生育醫學(xué)問(wèn)題提供全新解決方案。
論文鏈接：
https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(24)00446-6
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