核基因組突變是多種疾病的根源，而線(xiàn)粒體作為細胞內具有半自主功能的細胞器，擁有獨立的基因組，其基因組突變同樣與多種遺傳疾病密切相關(guān)。線(xiàn)粒體疾病通常累及多種組織器官，其中最為人熟知的包括 Leigh 綜合征和 LHON（Leber遺傳性視神經(jīng)病變）。Leigh 綜合征的癥狀包括發(fā)育遲緩、肌張力減退、運動(dòng)和呼吸障礙等，而 LHON 則表現為視力喪失、中央暗點(diǎn)和視神經(jīng)萎縮等問(wèn)題。根據 MITOMAP 的統計，目前已驗證的線(xiàn)粒體致病性突變有 97 個(gè)，其中點(diǎn)突變占比高達 95 %。然而，由于缺乏有效的點(diǎn)突變相關(guān)線(xiàn)粒體疾病小鼠模型，線(xiàn)粒體疾病的研究與治療開(kāi)發(fā)受到了嚴重制約。
早期的小鼠模型主要通過(guò)化學(xué)誘導或遺傳工程構建，但這些方法操作復雜、成本高昂且對突變的精準控制較差，僅成功建立了極少數模型。近年來(lái)，研究人員成功開(kāi)發(fā)了線(xiàn)粒體堿基編輯工具，可以對線(xiàn)粒體 DNA 實(shí)現 C to T 和 A to G 的堿基編輯，例如 DdCBE 和 TALED。這些工具基于雙鏈 DNA 脫氨酶 DddA 蛋白。雖然已有研究者嘗試將這些工具應用于小鼠模型的構建，但其編輯效率尚不足以模擬人類(lèi)線(xiàn)粒體疾病中高突變負荷的特征。此外，研究表明，DdCBE 可能引發(fā)大量核基因組脫靶效應，這種非 TALE 依賴(lài)性的脫靶主要源于 DddA 蛋白的自組裝以及其與 CTCF 的相互作用。因此，基于 DddA 的線(xiàn)粒體堿基編輯工具在應用中面臨核基因組脫靶的風(fēng)險，難以直接建立線(xiàn)粒體突變與疾病表型之間的因果聯(lián)系。
2025年1月23日，昌平實(shí)驗室、北京大學(xué)魏文勝團隊在 Nature 期刊發(fā)表了題為：Precise modelling of mitochondrial diseases using optimized mitoBEs 的研究論文【1】。
該研究報道了通過(guò)優(yōu)化后的 mitoBE 實(shí)現高效且精準地構建線(xiàn)粒體疾病小鼠模型的成果。利用優(yōu)化版 mitoBE，研究團隊成功建立了具有高突變頻率的小鼠模型，這些模型表現出了與疾病相關(guān)的典型表型。此外，通過(guò)雜交實(shí)驗，還獲得了突變負荷達到 100% 以及僅含單堿基突變的精確小鼠模型。
2023 年 5 月，魏文勝團隊在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Strand-selective base editing of human mitochondrial DNA using mitoBEs 的研究論文【2】。
該研究開(kāi)發(fā)了一種名為 mitoBE 的全新線(xiàn)粒體單堿基編輯工具，該工具不依賴(lài)于 DddA 系統，能夠高效地實(shí)現 A to G 或 C to T 的單堿基編輯。
還具備選擇性地編輯特定鏈的能力，這是 DddA 系統所不具備的。此外，該工具未觀(guān)察到明顯的脫靶現象。
此外，與 DdCBE 和 TALED 相比，mitoBE 展現出卓越的鏈特異性和顯著(zhù)降低的脫靶效應。得益于其雙向堿基編輯能力，mitoBE 能夠對大約 87% 的致病線(xiàn)粒體突變進(jìn)行精確建模。
為準確建立突變與疾病表型之間的直接聯(lián)系，消除堿基編輯工具的脫靶效應尤為重要。在利用 mitoBE 進(jìn)行建模時(shí)，需要將 RNA 編碼的 mitoBE 注射到小鼠受精卵中。因此，在這項新研究中，研究團隊首先對 RNA 編碼的 mitoBE 系統的脫靶效應進(jìn)行了全面評估。
結果表明，RNA 編碼的 mitoABE 存在廣泛的轉錄組脫靶效應，而 mitoCBE 則表現出一定程度的依賴(lài)于 APOBEC1 蛋白的線(xiàn)粒體基因組脫靶效應。為了提高 mitoBE 的精準性，研究團隊重點(diǎn)優(yōu)化了脫氨酶。
針對 mitoABE，通過(guò)突變篩選發(fā)現，TadA8e-V106W-V28F 能夠顯著(zhù)降低轉錄組脫靶至背景水平（圖1）。針對 mitoCBE，篩選了多種現有的胞嘧啶脫氨酶，并發(fā)現 TadA 衍生的胞嘧啶脫氨酶 CBE6d 在線(xiàn)粒體基因組上表現出的脫靶效應接近背景水平。
基于這些優(yōu)化成果，研究團隊將改進(jìn)后的 mitoBE 命名為 mitoBE v2，包括 mitoABE v2 和 mitoCBE v2（圖1）。此外，該研究還系統性地評估了優(yōu)化前后 mitoBE 在核基因組上的脫靶效應，結果顯示，無(wú)論是優(yōu)化前還是優(yōu)化后的 mitoBE，均未在核基因組上引發(fā)明顯的脫靶效應，從而驗證了其在基因編輯中的安全性和可靠性。
圖1. 優(yōu)化mitoBEs的編輯精準性
通過(guò)將 85 個(gè)人類(lèi)致病性線(xiàn)粒體 DNA 點(diǎn)突變與小鼠線(xiàn)粒體基因組進(jìn)行同源性比對，研究團隊確定了 70 個(gè)可編輯位點(diǎn)。進(jìn)一步的細胞水平初步篩選成功實(shí)現了其中 68 個(gè)位點(diǎn)的編輯。比較發(fā)現，由環(huán)狀 RNA（circRNA）編碼的 mitoBE v2 相比于線(xiàn)性 mRNA 編碼的工具，具有更高的編輯效率。
因此，研究團隊將 circRNA 編碼的 mitoBE v2 注射至小鼠胚胎并進(jìn)行移植，結果顯示 mitoBE v2 在多種 F0 代小鼠模型中均實(shí)現了較高的編輯效率，其中 mt-Nd5 A12784G F0 小鼠模型的突變頻率高達 82%（圖2）。此外，該研究系統性評估了 F0 代小鼠在線(xiàn)粒體基因組和核基因組中的脫靶效應，結果表明，在整個(gè)基因組范圍內未檢測到脫靶效應。這一發(fā)現表明，mitoBE v2 能夠構建遺傳背景干凈的線(xiàn)粒體疾病小鼠模型。更重要的是，線(xiàn)粒體基因組的編輯結果在小鼠不同組織中表現出廣泛且持久的存在（圖2），并且能夠通過(guò)母系遺傳穩定傳遞。通過(guò)進(jìn)一步雜交實(shí)驗，研究成功獲得了目標位點(diǎn)編輯效率達到 100% 以及僅含目標位點(diǎn)突變的 mt-Nd5 A12784G 小鼠模型。
圖2. mitoBE v2高效構建線(xiàn)粒體疾病小鼠模型，編輯結果廣泛且持久穩定于多組織
mt-Atp6 T8591C 和 mt-Nd5 A12784G 分別對應人類(lèi)線(xiàn)粒體致病突變 m.T9191C 和 m.A13379G，并分別導致 Leigh 綜合征和 LHON。研究團隊對突變率較高的 F0 代小鼠進(jìn)行了疾病表型評估，結果顯示，mt-Atp6 T8591C 小鼠表現出顯著(zhù)的心臟功能障礙，與 Leigh 綜合征的臨床特征相符；mt-Nd5 A12784G 小鼠則表現出類(lèi)似 LHON 的視力障礙（圖3）。此外，研究還通過(guò)調整 TALE 結合位點(diǎn)，成功構建了僅含目標位點(diǎn)編輯的單堿基突變 mt-Nd5 A12784G 小鼠模型。
圖3. 小鼠模型呈現出相應的線(xiàn)粒體疾病表型
總的來(lái)說(shuō)，這些研究結果充分證明了 mitoBE v2 在創(chuàng )建線(xiàn)粒體疾病小鼠模型方面的高效性和精準性，為深入探索線(xiàn)粒體疾病的致病機制及開(kāi)發(fā)新型治療策略提供了重要工具。
昌平實(shí)驗室、北京大學(xué)魏文勝教授，北京大學(xué)博士后伊宗裔為論文共同通訊作者，昌平實(shí)驗室博士后張小雪為論文第一作者，張雪、任紀武、李佳怡、魏曉旭和于瑩博士也為該研究做出了重要貢獻。該研究得到了昌平實(shí)驗室、國家自然科學(xué)基金、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心及中國博士后科學(xué)基金的資助。
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