摘要：在生物制造領(lǐng)域，工藝強化就像是一把神奇的鑰匙，能打開(kāi)提高生產(chǎn)效率、降低成本的寶藏大門(mén)。今天就來(lái)給大家講講一個(gè)真實(shí)的案例，看看中國倉鼠卵巢細胞系生產(chǎn)單克隆抗體的工藝，是怎么從傳統的老方法一步步升級，變成更厲害的強化工藝的。
過(guò)去 30 年，用哺乳動(dòng)物細胞培養來(lái)做生物制造，取得了很大的進(jìn)步。以前生產(chǎn)出來(lái)的東西濃度很低，只有 mg/L，現在能達到 g/L 了，成本也跟著(zhù)大幅下降。這主要靠?jì)?yōu)化細胞系、開(kāi)發(fā)更好的細胞培養基，還有調整生物反應器的參數這些方法。不過(guò)，在提高產(chǎn)量的同時(shí)，產(chǎn)品質(zhì)量也得保證。
可現在生物制造業(yè)還是面臨著(zhù)大挑戰，提高生產(chǎn)率和產(chǎn)量依舊是大家頭疼的難題。為了降低成本，學(xué)術(shù)界和企業(yè)都在研究怎么通過(guò)連續或半連續生物制造，把工藝強化一下。
工藝強化，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是用一些創(chuàng )新的技術(shù)和方法，讓生產(chǎn)過(guò)程變得更好，像提高生產(chǎn)率，還能減少制造成本和工廠(chǎng)的占地面積。在化學(xué)工業(yè)里，工藝強化早就成功應用了，效果特別好。但生物制造業(yè)不一樣，它監管很?chē)栏?，而且是用活的生物體生產(chǎn)昂貴的生物制劑，產(chǎn)量還比較小。就拿灌注細胞培養來(lái)說(shuō)，要不停地加新鮮培養基，去掉用過(guò)的培養基，還得用專(zhuān)門(mén)的設備把細胞留在生物反應器里，操作起來(lái)特別復雜。所以在生產(chǎn)單克隆抗體這類(lèi)蛋白質(zhì)的時(shí)候，灌注細胞培養還沒(méi)有被廣泛使用。不過(guò)，要是生產(chǎn)那些不穩定、濃度又低的蛋白質(zhì)，灌注細胞培養就很有用，能讓生產(chǎn)率提高不少。
最近，在補料分批生產(chǎn)加工里強化 N-1 種子培養，取得了很大進(jìn)展。以前傳統的補料分批培養，接種密度比較低，現在通過(guò) N-1 灌注接種，接種密度能大大增加。這樣一來(lái)，在更短的時(shí)間里，就能達到和傳統工藝差不多的最終濃度，工廠(chǎng)的產(chǎn)量也就提高了。而且這種方法不需要對現有的制造設備做太大改動(dòng)，所以在生物制藥行業(yè)用得很廣泛。就算不用灌注的 N-1 種子，用富集培養基培養出來(lái)的 N-1 種子，也能達到類(lèi)似的效果，操作還更簡(jiǎn)單。
再看看下游工藝，雖然也有一些進(jìn)步，比如蛋白 A 層析的裝載能力提高了，純化色譜步驟也有改進(jìn)，但隨著(zhù)上游產(chǎn)量大幅增加，下游操作還是拖了后腿，成了提高生產(chǎn)效率的瓶頸，而且成本也很高。所以現在大家都在想辦法強化下游工藝，像用連續色譜技術(shù)，還有連續病毒滅活和過(guò)濾這些方法。
在這個(gè)案例里，研究人員比較了三種生產(chǎn)單克隆抗體的生物制造工藝。工藝 A 是傳統的間歇工藝，工藝 B 和 C 是強化工藝。在工藝的上游部分，研究人員對 N-1 灌注進(jìn)行了開(kāi)發(fā)，讓補料批的濃度大幅提高；在下游部分，采用了兩個(gè)柱的 MCC 蛋白 A 捕獲技術(shù)，還有集成拋光步驟，讓下游的生產(chǎn)效率大大提升。同時(shí)，還對不同工藝的最終原料藥和消耗品成本進(jìn)行了分析和比較。
上游工藝大變化，產(chǎn)量質(zhì)量雙提升
從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，上游有很多地方都變了。像細胞系、基礎和進(jìn)料培養基不一樣了，N-2 和 N-1 種子培養的條件，還有補料分批生產(chǎn)生物反應器的條件，像接種密度、進(jìn)料情況、溫度等都有變化。
不同的 N-2 種子培養條件，最后得到的活細胞密度也不一樣。工藝 A、B、C 的 N-2 最終活細胞密度各不相同。用這些 N-2 種子去接種 N-1 種子生物反應器，接種密度也不一樣。而且 N-1 步驟的最終活細胞密度，從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C 是越來(lái)越高的。雖然工藝 C 在 N-1 種子階段的細胞存活率最后有點(diǎn)下降，但對后面的補料分批生產(chǎn)培養沒(méi)什么不好的影響。
到了補料分批生產(chǎn)階段，工藝 A、B、C 的初始接種密度也是逐漸增加的。細胞密度在培養過(guò)程中的變化也不一樣，工藝 C 的峰值細胞密度和最終細胞密度都是最高的。細胞存活率方面，工藝 B 和 C 一直都保持得很好，工藝 A 到后期就比較低了。
再看看產(chǎn)量，從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，最終標準化滴度越來(lái)越高，細胞比生產(chǎn)率也是工藝 C 最高。這主要是因為接種密度大幅增加，還有細胞系、培養基、生物反應器操作等方面的優(yōu)化。而且，工藝 B 和 C 在培養過(guò)程中，沒(méi)有出現什么大的放大問(wèn)題，一些代謝物和滲透壓濃度都控制得很好，比工藝 A 強多了。
下游工藝新變革，效率提升成本降
下游工藝從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，變化主要體現在三個(gè)色譜步驟的操作條件，還有最終配制的原料藥蛋白濃度上。
蛋白 A 步驟，工藝 A 用的樹(shù)脂負載能力有限，工藝 B 的樹(shù)脂負載能力提高了，工藝 C 采用新的模式，負載能力更高。AEX 步驟，三種工藝都用了流通模式，但工藝 B 和 C 的樹(shù)脂負載能力比工藝 A 高很多。CEX 步驟，工藝 A 是結合 - 洗脫模式，工藝 B 和 C 是流通模式，負載能力也增加了不少。而且，工藝 C 還采用了集成 AEX - CEX 操作，最終配制的原料藥濃度也提高了。
這些變化帶來(lái)了很多好處。從工藝 B 到工藝 C，生產(chǎn)率提高了，樹(shù)脂利用率也高了，緩沖液消耗減少，樹(shù)脂體積變小，處理時(shí)間還縮短了。雖然工藝 C 的下游收率一開(kāi)始比工藝 A 和 B 略低，但這是因為新設施啟動(dòng)時(shí)操作上有些問(wèn)題，調整之后就能達到和其他工藝相當的水平。
在去除雜質(zhì)方面，不管是哪種工藝，色譜步驟都能把雜質(zhì)去除到可接受的水平。工藝 B 和 C 在最終超濾 / 滲濾步驟的雜質(zhì)水平還更低一些。
最終產(chǎn)品質(zhì)量好，成本大幅降低
在產(chǎn)品質(zhì)量方面，工藝 B 和 C 的電荷均勻性比工藝 A 好。N - 連接聚糖方面，雖然不同工藝有些差異，但這些差異對產(chǎn)品質(zhì)量影響不大。工藝 B 和 C 的產(chǎn)品純度更高，不過(guò)從單體值來(lái)看，三種工藝又比較相似。酶聯(lián)免疫吸附試驗測定的效力，三種工藝也差不多。而且，三種工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品里，雜質(zhì)含量都很低，符合驗收標準。
在成本方面，研究人員對三種工藝進(jìn)行了 COG 分析，只考慮了消耗品成本。結果發(fā)現，從工藝 A 到工藝 B 再到工藝 C，上游和下游的成本都大幅減少，特別是從工藝 A 到工藝 B，變化最明顯。上游成本降低主要是因為滴度提高、培養基成本下降；下游成本降低是因為上游滴度增加、色譜過(guò)程優(yōu)化等。而且，對于不同的生產(chǎn)規模，上游和下游成本的比例也不一樣。
總結
這個(gè)案例成功展示了在 2000L 規模上，混合強化生物制造工藝（工藝 C）生產(chǎn)單克隆抗體的全過(guò)程。通過(guò)強化上游的 N-1 種子培養，還有優(yōu)化下游的色譜操作，不僅提高了上游的滴度和下游的生產(chǎn)率，還保證了產(chǎn)品質(zhì)量。而且，強化工藝很穩定，在臨床制造中也能成功擴大規模，成本還降低了不少。這為生物制造未來(lái)的發(fā)展，提供了一個(gè)很好的范例。
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