哺乳動(dòng)物著(zhù)床前胚胎發(fā)育是生命起始的關(guān)鍵階段。在這一過(guò)程中，具有全能性的受精卵會(huì )經(jīng)歷全基因組范圍的表觀(guān)遺傳重編程，通過(guò)精細的時(shí)空調控，逐步發(fā)育成完整胚胎以及多種胚外組織。這一過(guò)程涉及一系列關(guān)鍵發(fā)育事件：母代-子代轉換（Maternal-to-zygotic transition，MZT）、合子基因組激活（Zygotic genome activation，ZGA）、第一次細胞命運決定分化形成滋養外胚層（Trophectoderm，TE）和多能性的內細胞團 （Inner cell mass，ICM），以及第二次細胞命運決定由內細胞團進(jìn)一步分化為原始內胚層（Primitive endoderm，PE）和多能性的上胚層（Epiblast，EPI）等。此外，在雌性小鼠胚胎中，還需通過(guò)父本X染色體的印記失活（imprinted X chromosome inactivation，iXCI）維持X染色體基因劑量的平衡。這些精密的發(fā)育過(guò)程依賴(lài)于數十萬(wàn)個(gè)復雜的順式調控元件和數百個(gè)轉錄因子構成的協(xié)同調控網(wǎng)絡(luò )。

然而，由于技術(shù)限制，目前對哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的染色質(zhì)可及性研究仍然停留在群體細胞水平。著(zhù)床前胚胎中細胞數量稀少且難以獲得，同時(shí)在囊胚期已經(jīng)完成兩次細胞譜系分化，其染色質(zhì)狀態(tài)具有瞬時(shí)性和快速時(shí)空動(dòng)態(tài)變化等特征。群體細胞水平（bulk-level）的組學(xué)研究難以精確解析不同譜系細胞的染色質(zhì)狀態(tài)、胚胎內部異質(zhì)性等染色質(zhì)時(shí)空動(dòng)態(tài)變化。因此，以單細胞分辨率對哺乳動(dòng)物著(zhù)床前胚胎染色質(zhì)狀態(tài)進(jìn)行深入研究是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。

ATAC-seq（Assay for Transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing）是研究染色質(zhì)可及性和順式調控元件的核心工具之一?，F有的單細胞 ATAC-seq 方法雖然最后實(shí)現的是單個(gè)細胞的染色質(zhì)可及性測序，但是需要至少數千個(gè)細胞作為起始材料，因而難以對哺乳動(dòng)物著(zhù)床前胚胎進(jìn)行單細胞水平的解析。此外，傳統的短讀段 ATAC-seq 技術(shù)對于檢測著(zhù)床前胚胎發(fā)育過(guò)程中激活且發(fā)生動(dòng)態(tài)變化的重復元件存在局限性。來(lái)自重復元件的短讀段可能比對到多個(gè)基因組位點(diǎn)，從而因為歧義比對而在序列比對后被質(zhì)控過(guò)濾掉，導致這些基因組區域的表觀(guān)遺傳景觀(guān)一直處于未知狀態(tài)。此外，短讀段 ATAC-seq 技術(shù)覆蓋的遺傳變異有限，區分父母本等位基因的效率低下，限制了對基因組印記的研究。

2023年，湯富酬課題組開(kāi)發(fā)了首個(gè)基于單分子長(cháng)讀段測序平臺的單細胞 scNanoATAC-seq 技術(shù)，大大提高了 ATAC-seq 技術(shù)檢測重復元件染色質(zhì)可及性和等位基因特異性染色質(zhì)可及性方面的分析能力。雖然該技術(shù)最后實(shí)現的是單個(gè)細胞的染色質(zhì)可及性測序，但是仍需要數萬(wàn)個(gè)細胞作為起始材料，這嚴重限制了其在哺乳動(dòng)物著(zhù)床前胚胎發(fā)育中的應用。

2025年3月28日，北京大學(xué)生物醫學(xué)前沿創(chuàng )新中心（BIOPIC）湯富酬課題組與清華大學(xué)基礎醫學(xué)院紀家葵課題組合作，在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊 Science 上發(fā)表了題為：Chromatin Accessibility Landscape of Mouse Early Embryos Revealed by Single-cell NanoATAC-seq2 的研究論文。

該研究首次報道了適用于單細胞樣本起始的 ATAC-seq 技術(shù)——scNanoATAC-seq2。

該技術(shù)開(kāi)發(fā)了創(chuàng )新的單管反應體系，將多個(gè)實(shí)驗步驟集成在單個(gè)反應管中完成，最大 程度降低了樣品損失。通過(guò)長(cháng)片段富集，極大降低了文庫的線(xiàn)粒體 DNA 污染比率，實(shí)現了從單個(gè)細胞起始樣本獲取高質(zhì)量的染色質(zhì)可及性信息。研究團隊采用 scNanoATAC-seq2 技術(shù)對小鼠著(zhù)床前胚胎各發(fā)育階段進(jìn)行了系統、深入的單細胞分辨率染色質(zhì)可及性分析（圖1）。

圖1. scNanoATAC-seq2對小鼠著(zhù)床前胚胎發(fā)育十個(gè)關(guān)鍵階段進(jìn)行單細胞染色質(zhì)可及性分析

該研究的重要發(fā)現如下：

1、確立了X染色體印記失活和重新激活的表觀(guān)調控基礎

X 染色體上調控X染色體失活現象的有兩個(gè)相鄰的主要拓撲相關(guān)結構域：促進(jìn)X染色體失活的 X-ist 結構域和抑制X染色體失活的 Tsix 結構域。Xist結構域包含 X-ist、Jpx、Ftx 和 Rlim 等重要調控基因，其表達主要促進(jìn)所在 X 染色體的失活。而 Tsix 結構域包含 Tsix、Tsx 和 Linx 等重要調控基因，其表達主要抑制所在 X 染色體的失活，即促進(jìn)或維持該條 X 染色體的激活狀態(tài)。

利用兩種近交系小鼠交配產(chǎn)生的雜合胚胎進(jìn)行分析，該研究發(fā)現，在 4 細胞胚胎階段開(kāi)始的父本 X 染色體印記失活過(guò)程中，X-ist 結構域特異性增強父本 X 染色體在該區域的染色質(zhì)開(kāi)放性，從而促進(jìn)整條父本 X 染色體的印記失活。而此時(shí) Tsix 結構域保持父本和母本 X 染色體在該區域的對稱(chēng)開(kāi)放性，不參與父本 X 染色體的特異性印記失活（圖2）。發(fā)育到早期桑椹胚階段時(shí)，這一狀態(tài)發(fā)生逆轉，X-ist 結構域逐漸轉變?yōu)楦副竞湍副?X 染色體在該區域的對稱(chēng)開(kāi)放性，而 Tsix 結構域逐漸特異性增強母本 X 染色體在該區域的染色質(zhì)開(kāi)放性，保持母本 X 染色體處于活躍狀態(tài)，而仍然使整條父本 X 染色體維持印記失活狀態(tài)（圖2）。此后，在晚期囊胚階段，在兩個(gè)胚外譜系的細胞（滋養外胚層和原始內胚層）中保持這一由 Tsix 結構域主導的父本X染色體印記失活狀態(tài)。而在多能性的上胚層細胞中Tsix結構域重新逆轉回父本和母本 X 染色體在該區域的對稱(chēng)開(kāi)放性，印記失活的父本 X 染色體被重新激活，但是其激活程度仍然略低于母本 X 染色體。

圖2. X-ist與Tsix結構域調控父本X染色體印記失活和重新激活。

2、鑒定了調控合子基因組激活和早期胚胎兩次譜系命運決定的關(guān)鍵轉錄因子

對于結合基序已知的轉錄因子，通過(guò)分析其結合位點(diǎn)的染色質(zhì)狀態(tài)，ATAC-seq 可以準確鑒定每個(gè)轉錄因子的調控活性，準確判斷對應關(guān)鍵生物學(xué)事件的主導轉錄因子。通過(guò)對從受精卵到晚期囊胚的十個(gè)關(guān)鍵發(fā)育階段的分析，包括受精卵、早期2細胞、晚期2細胞、4細胞、早期8細胞、晚期8細胞、16細胞（早期桑葚胚）、晚期桑椹胚期、早期囊胚和晚期囊胚，該研究準確鑒定了該過(guò)程中每個(gè)發(fā)育階段和每個(gè)分化譜系的關(guān)鍵轉錄因子（圖3）。scNanoATAC-seq2 分析提示，這些轉錄因子的基因體和轉錄因子下游結合位點(diǎn)上的表觀(guān)激活程度在發(fā)育過(guò)程中協(xié)同變化。這為后續通過(guò)基因敲除等手段對每個(gè)主導轉錄因子的功能進(jìn)行精細分析奠定了基礎，也為研究著(zhù)床前胚胎的每個(gè)發(fā)育階段的核心轉錄因子網(wǎng)絡(luò )提供了表觀(guān)組學(xué)依據。

圖3. 調控小鼠著(zhù)床前胚胎各階段發(fā)育的主導轉錄因子

3、揭示了主要重復元件類(lèi)別在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的表觀(guān)調控特點(diǎn)

哺乳動(dòng)物基因組中大約一半都是由重復元件組成的。一些重要類(lèi)型的重復元件在基因組中有數千個(gè)序列幾乎一模一樣的拷貝，分散分布在整個(gè)基因組中。例如全長(cháng) LINE1 重復元件拷貝的長(cháng)度在 6 kb 左右，同一亞家族內兩個(gè)拷貝之間的序列相似度能夠達到 99% 以上。二代短讀段測序很難區分這些不同的拷貝，因而無(wú)法判斷其染色質(zhì)狀態(tài)（圖4）。該研究發(fā)現大部分全長(cháng) LINE1 在卵裂期染色質(zhì)開(kāi)放度下降，而后在囊胚期上升。然而，存在 157 個(gè)調控模式相反的全長(cháng) LINE1 拷貝，其染色質(zhì)開(kāi)放度在卵裂期上升，而后在囊胚期下降，可能涉及常染色質(zhì)-異染色質(zhì)的區室形成。

MERVL 屬于長(cháng)末端重復序列（long terminal repeat，LTR）家族，全長(cháng)約 6kb，中間為內源逆轉錄病毒（endogenous retrovirus，ERV）蛋白編碼序列，兩端為輔助轉座和順式調控的 MT2-mm 元件。先前的研究表明，這類(lèi)轉座子在合子基因組激活過(guò)程中被廣泛激活并轉錄，人為沉默 MERVL 會(huì )導致小鼠著(zhù)床前發(fā)育異常。由于小鼠基因組中 570 個(gè)完整 MERVL 元件的序列高度相似，短讀段測序技術(shù)難以實(shí)現唯一比對。利用 5 kb 以上的長(cháng)讀段（涵蓋MERVL側翼的非重復序列），scNanoATAC-seq2 能夠實(shí)現 MERVL 來(lái)源 DNA 片段的唯一比對，從而精確描繪每個(gè)拷貝的 MERVL 的表觀(guān)激活特征。在晚期2細胞階段發(fā)生的合子基因組激活中，MERVL 的表觀(guān)激活發(fā)生于兩端的 MT2-mm 重復元件，而內部的 ERV 編碼序列所在的染色質(zhì)保持相對關(guān)閉狀態(tài)。此外，逐個(gè)拷貝分析的染色質(zhì)可及性表明，這些序列相似的 MERVL 元件之間仍存在表觀(guān)激活程度的差異。在 scNanoATAC-seq2 鑒定的活躍 MERVL 元件附近（30 kb以?xún)龋?，相應的靶基因呈現 ZGA 表達激活（如Zscan4c、Zscan4d和Sp110）；相反，表觀(guān)遺傳沉默的 MERVL 元件附近基因的表達則在 ZGA 過(guò)程中未激活。

圖4. scNanoATAC-seq2鑒定序列高度相似的不同拷貝重復元件的染色質(zhì)狀態(tài)

4、鑒定了一批新的小鼠早期胚胎非經(jīng)典印記基因

scNanoATAC-seq2 技術(shù)能夠高效區分父、母本等位基因，適合研究發(fā)育中的基因印記。在 C57×DBA 和 C57×CAST 雜合胚胎中，該研究分別識別了 47% 和 97% 的染色質(zhì)可及性的親本來(lái)源。利用這些數據，該研究描繪了染色質(zhì)可及性介導的非經(jīng)典印記的動(dòng)態(tài)變化（不依賴(lài)DNA甲基化）。結果顯示，非經(jīng)典印記強度在著(zhù)床前發(fā)育過(guò)程中逐漸消失，并在晚期囊胚譜系分化后降至最低水平。該研究最晚在8細胞胚胎階段觀(guān)測到較強的等位基因特異性染色質(zhì)可及性。由此，通過(guò)反交胚胎驗證，研究人員在該發(fā)育階段鑒定出 325 個(gè)小鼠非經(jīng)典印記基因。其中 266 個(gè)基因是相較于 Inoue 等人的研究新鑒定出來(lái)的父源非經(jīng)典印記基因。Inoue 等人的研究是基于孤雌和孤雄小鼠桑葚胚的染色質(zhì)可及性差異，而不是基于正常胚胎發(fā)育過(guò)程的等位基因特異性染色質(zhì)可及性分析得出的。

5、發(fā)現16細胞胚胎階段已經(jīng)出現胚內和胚外譜系分化的染色質(zhì)可及性特征

該研究鑒定了早期囊胚中內細胞團和滋養外胚層譜系特異性的染色質(zhì)開(kāi)放區域特征，并且以此為基礎解析其他發(fā)育階段的胚內異質(zhì)性。結果表明，小鼠胚胎發(fā)育至16細胞階段時(shí)，首次出現了表觀(guān)基因組層面的內細胞團和滋養外胚層命運分化特征（圖5）。這提示在囊胚腔出現之前，囊胚中兩種譜系的分化特征已然在16細胞胚胎（早期桑葚胚）階段的染色質(zhì)可及性層面出現。

圖6. 小鼠胚胎發(fā)育16細胞期出現細胞譜系分化的染色質(zhì)可及性特征

總之，該研究利用單細胞起始的 scNanoATAC-seq2 技術(shù)，構建了涵蓋小鼠著(zhù)床前發(fā)育全過(guò)程的高精度單細胞染色質(zhì)可及性圖譜，系統鑒定了不同發(fā)育階段、不同譜系細胞的關(guān)鍵轉錄因子，揭示了調控合子基因組激活和譜系分化（上胚層、原始內胚層和滋養外胚層）的順式調控網(wǎng)絡(luò )。此外，還解析了雌性胚胎中父本 X 染色體的印記失活與重新激活，以及非經(jīng)典印記基因的表觀(guān)調控基礎。這些發(fā)現為理解包括人類(lèi)在內的哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育的分子機制提供了新的線(xiàn)索。

北京大學(xué)生物醫學(xué)前沿創(chuàng )新中心湯富酬研究員、文路副研究員與清華大學(xué)基礎醫學(xué)院紀家葵研究員為該論文的共同通訊作者。清華大學(xué)基礎醫學(xué)院博士生李孟瑤博士（已畢業(yè)）與北京大學(xué)生物醫學(xué)前沿創(chuàng )新中心博士生蔣振寰為該論文的并列第一作者。

論文鏈接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adp4319