2012 年，CRISPR-Cas9的發(fā)現開(kāi)啟了基因編輯新時(shí)代，此后的十多年里，基于CRISPR的基因編輯技術(shù)得到了快速發(fā)展，并被成功應用放到了人體臨床試驗中已治療遺傳疾病和癌癥。與此同時(shí)，全世界的科學(xué)家們也在不斷挖掘新的具有基因編輯潛力的新工具，以解決Cas9 蛋白體積過(guò)大（約1400個(gè)氨基酸），難以通過(guò) AAV 病毒載體進(jìn)行遞送以進(jìn)行體內基因編輯的難題。
該研究通過(guò)對 CRISPR-Cas9 的祖先IscB進(jìn)行進(jìn)化改造，成功創(chuàng )造出僅有 Cas9 一半大小的NovalscB系統（僅 614 個(gè)氨基酸），基因編輯效率提升百倍，研究團隊將NovalscB系統與甲基轉移酶融合，進(jìn)而創(chuàng )建一個(gè)可編程的表觀(guān)遺傳編輯系統——OMEGAoff，其緊湊程度足以被裝載到單個(gè)腺相關(guān)病毒（AAV）載體中，通過(guò)單次 AAV 注射即可實(shí)現長(cháng)達 6 個(gè)月的持久基因表達抑制。
2025 年 5 月 7 日，張鋒團隊在Nature Biotechnology期刊發(fā)表了題為：Evolution-guided protein design of IscB for persistent epigenome editing in vivo的研究論文。
該研究通過(guò)整合直系同源物篩選、進(jìn)化和結構引導相結合的蛋白質(zhì)工程方法、RNA 工程以及基于深度學(xué)習的結構預測，對 IscB 蛋白及其向導 RNA（ωRNA）進(jìn)行工程化改造，從而生成了NovaIscB。
這一緊湊型基因編輯工具NovaIscB在人類(lèi)基因組上實(shí)現了高達 40% 的插入/缺失編輯活性（效率相比野生型 OgeuIscB 提升約 100 倍），并且相對于現有的 IscB 具有更高的特異性。該研究進(jìn)一步證明，NovaIscB 可與甲基轉移酶融合，從而創(chuàng )建一個(gè)可編程的表觀(guān)遺傳編輯系統——OMEGAoff，其緊湊程度足以被裝載到單個(gè)腺相關(guān)病毒（AAV）載體中，可在體內實(shí)現持久的基因抑制（持久抑制PCSK9 基因表達，顯著(zhù)降低膽固醇水平，效果持續超過(guò) 6 個(gè)月）。
更重要的是，該研究提出的結合進(jìn)化和結構引導的蛋白質(zhì)工程方法，為優(yōu)化蛋白質(zhì)功能提供了一個(gè)新框架，其潛在應用遠遠超出了基因組編輯的范疇。
Cas9 的祖先：IscB 的先天優(yōu)勢與短板
在基因編輯領(lǐng)域，如何將基因編輯器精準且高效地遞送到體內特定的組織/器官，始終是一項重大挑戰。
2021年9月，張鋒團隊在Science期刊發(fā)表論文，發(fā)現了一類(lèi)廣泛的轉座子編碼的 RNA 引導核酸酶，并將其命名為OMEGA 系統（包括IscB、IsrB、Tnp8），它們同樣使用一段RNA（ωRNA）來(lái)指導切割 DNA 雙鏈。
其中，IscB被認為是 Cas9 的祖先，更重要的是，IscB 非常小，大約 300-550 個(gè)氨基酸，僅為Cas9 的約 30%，這意味著(zhù)它們可被開(kāi)發(fā)為新的小型化基因編輯工具，從而更容易被遞送到細胞內。
但原始的 IscB 存在三大硬傷：
1、有效向導RNA 長(cháng)度僅 13bp，導致特異性較低，易脫靶，與之相比，Cas9 的有效向導RNA 長(cháng)度為 17-20bp；
2、編輯效率不足野生型 Cas9 的 1%；
3、無(wú)法適配復雜的表觀(guān)遺傳編輯工具。
進(jìn)化指導的智能改造：四步打造基因魔剪
張鋒團隊采用“自然篩選+人工智能”的創(chuàng )新策略，通過(guò)四個(gè)關(guān)鍵步驟重塑 IscB：
1、自然寶庫篩選
從 144 種 IscB 天然變體中，發(fā)現源自人類(lèi)腸道微生物的 OrufIscB，其編輯效率比前代提升 5-10 倍。
2、結構嫁接
將 Cas9 的 REC 結構域（負責識別和結合目標 DNA 序列）精準移植到 IscB，將有效 引導RNA 長(cháng)度延長(cháng)至 20bp，脫靶率降低 3 倍。
3、定向進(jìn)化
通過(guò)深度突變掃描，篩選出關(guān)鍵位點(diǎn)E137K/E409R/I533K，使編輯活性再提升 2 倍。
4、RNA工程
精簡(jiǎn)向導RNA 結構，將其從 225nt 縮短至 166nt，使人類(lèi)細胞中的向導RNA（ωRNA）表達量提升4 倍，適配化學(xué)合成遞送。
通過(guò)這四個(gè)步驟，張鋒團隊創(chuàng )造了NovalscB系統：
• 編輯效率達 40%，媲美傳統 Cas9；
• 特異性與 SpCas9 相當，遠超同類(lèi)小型化基因編輯工具；
• 整個(gè)系統尺寸（IscB蛋白 + gRNA）僅 614aa + 166nt，輕松裝入單個(gè) AAV 病毒。
更重要的是，NovalscB系統還可進(jìn)一步用于構建堿基編輯器和表觀(guān)遺傳編輯器。
體內持久編輯：改寫(xiě)表觀(guān)基因編輯的新可能
張鋒團隊進(jìn)一步將切割活性喪失的 NovalscB 與甲基轉移酶融合，構建了表觀(guān)遺傳編輯器——OMEGAoff系統。
研究團隊使用單個(gè) AAV 載體包裝OMEGAoff 系統，通過(guò)靜脈注射遞送，靶向編輯 PCSK9 基因，結果顯示，從注射后 3 周開(kāi)始，小鼠血清中 PCSK9 蛋白水平顯著(zhù)降低，從注射后 4 周開(kāi)始，小鼠血清中膽固醇水平顯著(zhù)顯著(zhù)下降，降低幅度與使用 PCSK9 單抗的臨床效果相當，這些效果穩定持續到實(shí)驗結束（6 個(gè)月）。為了評估OMEGAoff 系統的毒性，研究團隊在實(shí)驗結束時(shí)檢測了血清總膽紅素和丙氨酸氨基轉移酶水平，未觀(guān)察到顯著(zhù)變化。這些結果突顯了使用 OMEGAoff 進(jìn)行持久基因抑制和表觀(guān)基因組編輯的潛力。
總的來(lái)說(shuō)，這項研究通過(guò)進(jìn)化和結構引導的蛋白質(zhì)設計，研究了1000 多種變體，從而創(chuàng )建了NovaIscB以及基于NovaIscB 的表觀(guān)遺傳編輯器——OMEGAoff系統，為基因編輯以及表觀(guān)遺傳編輯工具箱提供了有前景的新工具。該研究提出的結合進(jìn)化和結構引導的蛋白質(zhì)工程方法，為優(yōu)化蛋白質(zhì)功能提供了一個(gè)新框架，其潛在應用遠遠超出了基因組編輯的范疇。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-025-02655-3
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