在生物制藥的 "江湖" 里，想要精準拿捏哺乳動(dòng)物細胞的生長(cháng)節奏，那可真是堪比 "馴服一匹烈馬"-- 難上加難！不過(guò)別慌，我們這次帶來(lái)了一套超牛的 "細胞改造秘籍"，要用多層次細胞工程策略，把哺乳動(dòng)物細胞的生長(cháng)階段安排得明明白白！

       咱們先給細胞來(lái)一場(chǎng) "死亡抵抗特訓"。利用 CRISPR/Cas9 這把 "基因剪刀"，果斷敲除促凋亡蛋白 Bax 和 Bak。這就好比給細胞穿上了 "死亡免疫鎧甲"，大大降低了細胞凋亡的概率，不僅提高了細胞活力，還成功給細胞的 "壽命" 續費，讓它們能在培養過(guò)程中 "超長(cháng)待機"。

       光有 "抗衰 buff" 可不夠，接下來(lái)得給細胞裝個(gè) "加速引擎"。我們整出了一套類(lèi)似 "油門(mén)" 的生長(cháng)加速系統，基于脫落酸誘導系統，精準調控 cMYC 基因表達。只要輕輕一踩 "油門(mén)"，細胞就像開(kāi)了掛一樣，瘋狂增殖，細胞密度 "蹭蹭" 往上漲，細胞周期也被我們穩穩掌控。

       有了 "油門(mén)"，自然也得配上 "剎車(chē)"。于是，我們又打造了一個(gè)基于 BLIMP1 基因的四環(huán)素誘導基因回路，就像汽車(chē)的 "剎車(chē)踏板"。一旦激活，細胞立馬 "踩剎車(chē)"，停止生長(cháng)，細胞周期也被牢牢阻滯在特定階段。

       最后，終極 "王炸" 來(lái)了！我們把 "油門(mén)" 和 "剎車(chē)" 合二為一，開(kāi)發(fā)出雙重可控系統。這下，哺乳動(dòng)物細胞的生長(cháng)動(dòng)力學(xué)就像被我們握在手中的提線(xiàn)木偶，想快就快，想停就停，實(shí)現了動(dòng)態(tài)又精準的調控！

       這項研究堪稱(chēng)合成生物學(xué)工具和組合細胞工程應用的 "神仙打架" 現場(chǎng)，不僅為操縱哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)搭建了一個(gè)超復雜的框架，還為生物制藥生產(chǎn)和生物醫學(xué)應用提供了一個(gè)超獨特的范例，簡(jiǎn)直就是科研界的 "六邊形戰士"！

       亮點(diǎn)

•        生物生產(chǎn)界的 "精密儀器"：設計哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)動(dòng)力學(xué)，讓生物生產(chǎn)精度直接 "拉滿(mǎn)"，誤差？不存在的！
•        基因控制界的 "老司機組合"：利用正交誘導電路，打造生長(cháng)控制的 "油門(mén)和剎車(chē)" 系統，細胞生長(cháng)節奏由我們說(shuō)了算！
•        細胞平臺界的 "全能選手"：定制生長(cháng)階段，產(chǎn)出多功能哺乳動(dòng)物平臺，生產(chǎn)效率高、結果超可預測，生物制藥的未來(lái)就靠它了！

       簡(jiǎn)介

       在復雜生物藥物生產(chǎn)的 "C 位"，永遠站著(zhù)哺乳動(dòng)物細胞這位 "大佬"，不管是重組單克隆抗體，還是基于病毒載體的產(chǎn)品，都離不開(kāi)它的 "辛勤勞作"。在典型的生物制藥批次生產(chǎn)中，哺乳動(dòng)物細胞的生長(cháng)就像一場(chǎng) "闖關(guān)游戲"，要經(jīng)歷生長(cháng)、穩定和衰退死亡這些關(guān)卡，每一關(guān)都決定著(zhù)細胞是 "努力干活生產(chǎn)產(chǎn)品"，還是 "躺平擺爛"。

       控制細胞生長(cháng)的機制，那叫一個(gè) "盤(pán)根錯節"，外在的營(yíng)養物質(zhì)、生長(cháng)因子，內在的細胞周期調節劑、應激反應，各種因素 "你方唱罷我登場(chǎng)"，交織成一張復雜的大網(wǎng)。盡管現有的生物工藝策略已經(jīng)能在一定程度上調節培養階段，但想要精準控制細胞生長(cháng)動(dòng)力學(xué)，還是像在迷霧中找路 -- 難??！

       不過(guò)，要是能給細胞裝上一套 "油門(mén)和剎車(chē)" 系統，實(shí)現對生長(cháng)和穩定期的動(dòng)態(tài)控制，那可就厲害了！就像給汽車(chē)發(fā)動(dòng)機配上了 "黃金搭檔"，操控性直接起飛！而要打造這套系統，關(guān)鍵就在于找到能調節細胞周期和代謝關(guān)鍵基因表達的 "神秘鑰匙"。

       在我們之前的研究里，發(fā)現了 cMYC 和 BLIMP1 這兩位 "寶藏選手"。它們就像細胞世界里的 "油門(mén)" 和 "剎車(chē)"，在 B 細胞和漿細胞的發(fā)育過(guò)程中，上演著(zhù)一場(chǎng)精彩絕倫的 "愛(ài)恨情仇"。cMYC 在早期 B 細胞中 "風(fēng)頭無(wú)兩"，掌控著(zhù)細胞增殖、存活和代謝；而 BLIMP1 一登場(chǎng)，就像給 cMYC 按下了 "暫停鍵"，抑制它及其下游靶標，助力細胞向抗體分泌狀態(tài) "華麗變身"。

       cMYC 要是 "放飛自我" 異位表達，細胞就會(huì )瘋狂增殖，細胞周期也變得 "整整齊齊"，活脫脫一副癌細胞的 "囂張模樣"。相反，BLIMP1 要是 "過(guò)度發(fā)力" 過(guò)表達，細胞就會(huì )被 "強制下線(xiàn)"，生長(cháng)停止，細胞周期停滯在 G1/G0 期。

       但改造細胞生長(cháng)動(dòng)力學(xué)可不是一帆風(fēng)順的，還得小心 "凋亡陷阱"。cMYC 的 "超速增殖" 和 BLIMP1 的 "持續剎車(chē)"，都可能觸發(fā)細胞凋亡的 "警報"。cMYC 高表達會(huì )通過(guò)上調促凋亡蛋白或者引發(fā) DNA 損傷反應，把細胞往凋亡的 "懸崖" 上推；BLIMP1 也不甘示弱，通過(guò)內質(zhì)網(wǎng)應激和激活未折疊蛋白反應，誘導細胞走向凋亡。所以，用 cMYC 和 BLIMP1 當 "油門(mén)" 和 "剎車(chē)"，得像走鋼絲一樣小心翼翼，還得順便改造一下細胞的死亡階段，把潛在的凋亡風(fēng)險 "扼殺在搖籃里"。

       在本研究中，我們決定 "挑戰極限"，對細胞的對數增長(cháng)、穩定期和死亡這三個(gè)關(guān)鍵階段 "下手"。為此，精心設計了一套多層次細胞工程策略，用上 CRISPR/Cas9 基因組工程和正交可誘導基因回路，實(shí)現對 cMYC 和 BLIMP1 表達的 "花式調控"。

       一開(kāi)始，我們先敲除 Bax 和 Bak，打造出抗死亡的哺乳動(dòng)物細胞平臺。接著(zhù)，給細胞系 "升級裝備"，讓它能表達 r - 單克隆抗體，再把控制 cMYC 和 BLIMP1 基因表達的回路 "安裝" 到基因組里。最后，開(kāi)發(fā)出雙重可控系統，實(shí)現對細胞生長(cháng)階段的精準控制，充分展示了基因重新設計在生物工藝中的巨大潛力！想知道具體的實(shí)驗操作和結果？快到原文里一探究竟吧！

       圖 1.利用 CRISPR/Cas9 介導的敲除 (KO) 技術(shù)構建抗死亡哺乳動(dòng)物細胞。A ) 培養過(guò)程中哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)階段示意圖。B) 本研究中應用的細胞工程和細胞系開(kāi)發(fā)工作流程。C) Bax (NW_003614570.1) 和 Bak (NW_003614972.1) 基因中外顯子（白色）和內含子（黑色）示意圖。靶向 Bax 和 Bak 外顯子 1-3 的gRNA 序列如表 S1所示。D) 對照 CHOK1 (HD)、Bax SKOs (X 1-5 )、Bak SKOs (K 1-6 ) 和 Bax-Bak DKOs (XK 1-8 ) 中Bax、Bak和 ERK蛋白表達的蛋白質(zhì)印跡分析。紅色方形框表示使用批次培養進(jìn)一步表征的克隆。此外，圖S3描述了Bax、Bax SKO和DKO細胞系所有克隆的批次培養特性。E)和F) Bax SKO、Bak SKO和Bax-Bak DKO細胞系的活細胞密度和細胞活力概況。(黑色)對照CHOK1宿主，(藍色)Bax SKO (CHOX 5 )，(綠色)Bak SKO (CHOK 4 )和(白色)Bax-Bak DKO (CHOXK 6 )。實(shí)驗值代表三次生物學(xué)重復(n = 3)的平均值±SEM。

       結果

       哺乳動(dòng)物細胞死亡階段的調控

       調控哺乳動(dòng)物細胞的生長(cháng)階段，就像在玩一場(chǎng)超復雜的 "基因拼圖游戲"，每個(gè)階段都得精準 "拿捏"（圖 1A）。為了完成這場(chǎng) "游戲"，我們制定了一套連續細胞工程方案，分三步 "通關(guān)"：減弱細胞死亡、加速對數生長(cháng)期、激活穩定期（圖 1B）。

       第一關(guān)，先解決細胞死亡的 "大麻煩"。我們派出 CRISPR/Cas9 這員 "大將"，針對促凋亡蛋白 Bax 和 Bak 發(fā)起 "進(jìn)攻"，目標是打造抗死亡的哺乳動(dòng)物細胞系。就像設計 "尋寶路線(xiàn)" 一樣，我們根據 Bax 和 Bak 的編碼序列，設計了三個(gè)引導 RNA（gRNA），專(zhuān)門(mén) "瞄準" 轉錄本外顯子缺失。

       第一輪 "戰斗"，我們分別對 Bax 和 Bak 進(jìn)行單敲除（SKO），然后用有限稀釋克隆法，像 "大海撈針" 一樣篩選出單細胞克隆。最后成功分離出 5 個(gè) Bax SKO 單細胞克?。–HOX 1 至 CHOX 5）和 6 個(gè) Bak SKO 單細胞克?。–HOK 1 -CHOK 6）。

       為了確認 "戰斗成果"，我們用 TIDE PCR 在基因組水平上查看是否有插入或缺失，再用 Western blot 在蛋白質(zhì)水平上 "驗明正身"。確認無(wú)誤后，我們選了 Bak SKO 克隆 CHOK 1 和 CHOK 6，發(fā)起第二輪 "進(jìn)攻"，生成 Bax/Bak 雙 KO (DKO) 細胞克隆。又經(jīng)過(guò)一番 "精挑細選"，從親本宿主中分離出 8 個(gè) Bax/Bak DKO 細胞克?。–HOXK 1-4 和 CHOXK 5-8），并且所有克隆都在基因組和蛋白質(zhì)組水平上成功實(shí)現 Bax 和 Bak 敲除。

       對這些克隆進(jìn)行初步 "體檢"，發(fā)現它們在減緩細胞活力下降方面效果顯著(zhù)（圖S3）。我們從中挑出 CHOX 5、CHOK 4 和 CHOXK 6 細胞系，和親本 CHOK1 一起進(jìn)行標準批次培養，看看它們的生長(cháng)和細胞活力有啥不同。結果發(fā)現，SKO 和 DKO 細胞系的生長(cháng)曲線(xiàn) "神同步"，生長(cháng)率和細胞密度峰值都差不多，而且細胞活力比對照 "蹭蹭" 往上漲（圖 1D 和 E）。特別是 Bax 和 Bak DKO，在提高細胞活力上還有 "1+1>2" 的協(xié)同效果！這波操作，直接讓細胞死亡大幅減輕！

       細胞抗死亡能力有了，接下來(lái)得看看它們的 "生產(chǎn)能力"。我們給 Bax 和 BakDKO 細胞系以及對照 CHOK1 細胞系 "加載" r-IgG1 抗體生產(chǎn)程序，用含有人源 IgG1 抗體序列的表達載體轉染細胞，再經(jīng)過(guò)嘌呤霉素抗性篩選，找到單細胞克?。–HOXKIgG1 和 CHOK1 IgG1）。

       在 14 天的標準批次培養中，我們全程 "緊盯" 這些細胞的生長(cháng)、活力、IgG1產(chǎn)生和凋亡狀態(tài)（圖 2）。結果令人驚喜！和對照 CHOK1 IgG1 細胞系相比，Bax 和 Bak DKO 細胞系就像開(kāi)了 "生產(chǎn)外掛"，培養壽命延長(cháng)，活力滿(mǎn)滿(mǎn)（圖 2A 和 B），IgG1 產(chǎn)量和細胞特異性產(chǎn)量也更高（圖 2C 和 D），而且并不是因為 IgG1 產(chǎn)生細胞系生長(cháng)過(guò)程有變化，而是培養壽命延長(cháng)帶來(lái)的 "福利"。

       我們還仔細檢查了凋亡信號通路，發(fā)現 Bax 和 Bak 蛋白 "消失得無(wú)影無(wú)蹤"，它們的下游效應分子（裂解的 caspase 3 和 7 以及 caspase 9）在不同培養時(shí)間點(diǎn)的表達也大幅降低（圖 2F）。這直接導致 CHOXK IgG1 在培養第7 天和第 8 天的細胞凋亡數量顯著(zhù)減少（圖 2G）?？磥?lái)，Bax 和 Bak DKO 是通過(guò) "切斷" 下游信號蛋白級聯(lián)反應，成功減少了細胞凋亡！

       圖 2.IgG1產(chǎn)生型抗死亡細胞系的開(kāi)發(fā)。A )、B) 和 C) CHOXK IgG1 和對照 CHOK1 IgG1細胞系的活細胞密度、細胞活力和 IgG1 產(chǎn)生情況。D) 細胞特異性生產(chǎn)力。E) IgG1 重鏈 (HC) 和輕鏈(LC) mRNA 表達。F) 凋亡相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析：Bak、Bax、Caspase 3、7 和 9。G) 使用Annexin V/PI染色進(jìn)行凋亡分析。(*)、(**)、(***) 和 (****) 分別表示 p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（t檢驗）。實(shí)驗值代表三個(gè)生物學(xué)重復 (n = 3) 的平均值 ± SEM。

       加速細胞生長(cháng)：一場(chǎng)需要 "剎車(chē)" 的競速賽

       在哺乳動(dòng)物細胞的 "成長(cháng)賽道" 上，提升細胞生長(cháng)速度這事兒，和細胞系開(kāi)發(fā)、生物工藝放大可算是 "拜了把子"，關(guān)系鐵得很！但要是放任細胞撒丫子瘋長(cháng)，就好比給沒(méi)駕照的新手一輛超跑 -- 麻煩大了！不受控制的快速生長(cháng)，會(huì )讓細胞出現基因型、表型 "大變臉"，還可能觸發(fā)凋亡事件，在培養過(guò)程中直接"擺爛"，交出糟糕的 "成績(jì)單"。所以說(shuō)，設計一套細胞生長(cháng)加速系統，必須得給它配上 "高精度方向盤(pán)" 和 "強力剎車(chē)"，實(shí)現超穩操控！

       為了拿捏住細胞生長(cháng)的 "命脈"，我們整出了一個(gè)超牛的基因組整合系統，它的核心 "操盤(pán)手" 是 cMYC 基因 -- 這位可是細胞增殖界的 "明星誘導劑"，名氣響當當！接著(zhù)，我們又構建了一個(gè)能被培養基里的脫落酸（ABA）"喚醒" 的誘導性遺傳回路，咱給它取名叫 ABA-MYC。ABA-MYC 系統的 "工作原理" 就像一場(chǎng)精妙的分子 "雙人舞"：當 ABA 出現，PYL1 和 ABI 結構域就開(kāi)始 "貼貼"，跳起可逆二聚化的 "華爾茲"。這一 "貼" 可不得了，PYL1融合的 VP16 轉錄激活結構域，就會(huì )像被施了魔法一樣，順著(zhù) ABA 的 "指揮棒"，精準 "募集" 到和 PhIF 阻遏物（TET 阻遏物的 "親兄弟"）相連的DNA 結合結構域上，而這個(gè)結構域又和 ABI "手拉手"（見(jiàn)圖 3A）。為了防止ABA-MYC 系統突然 "抽風(fēng)" 意外啟動(dòng)，我們還在 PhIF DNA 結合結構域和ABI 之間安了個(gè) "核輸出信號（NES）"，就像給它們之間加了一道 "安全門(mén)"；同時(shí)，給 VP16-PYL1 連上核定位信號，確保分子 "舞蹈" 按劇本走。這些分子元件 "通力合作"，讓二聚化的 PhIF-NES-ABI 和 NLS-VP16-PYL1 順利 "沖進(jìn)" 細胞核，瞬間激活 cMYC 基因和報告基因 mCherry 蛋白的 "表演"。為啥選 ABA 誘導系統？因為它夠 "低調"，背景激活值低，一旦被激活，又能 "高調" 輸出，實(shí)現高水平表達，妥妥的 "寶藏選手"！

       為了驗證這套系統是不是真的 "能打"，我們培養出了整合 ABA-MYC 回路的 CHOXKIgG1 細胞系的穩定克隆細胞系，這樣就能通過(guò)在培養基里加 ABA，像調節音量旋鈕一樣，精準控制 cMYC 的 "表達音量"。實(shí)驗結果超給力！通過(guò) ABA-MYC 回路的誘導，我們在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平，都實(shí)現了對 cMYC 和 mCherry 基因表達的精準 "拿捏"，而且表達量和 ABA 濃度完美 "掛鉤"（見(jiàn)圖 3B、C 和 D）。cMYC 一被激活，細胞就像打了 "生長(cháng)雞血"，生長(cháng)速度狂飆，IgG1 的產(chǎn)量也跟著(zhù) "搞事情"。我們發(fā)現，培養基里的 ABA 濃度越高，細胞密度就 "蹭蹭" 往上漲（見(jiàn)圖 3E 和 F），細胞活力也跟著(zhù) "水漲船高"，這大概是因為 cMYC 對細胞有 "續命" 的神奇功效。不過(guò)，細胞增殖加快，細胞周期分布也 "變了天"：G1 期細胞數量 "縮水"，G2 期細胞數量 "暴漲"，只有 S 期 "穩如泰山"（見(jiàn)圖 3G）。但在 IgG1 產(chǎn)量這邊，劇情卻來(lái)了個(gè)大反轉 --cMYC 表達越高，產(chǎn)物滴度和細胞特異性產(chǎn)量反而越低（見(jiàn)圖 3H 和 I）。這就好比細胞在 "生長(cháng)" 和 "生產(chǎn)" 之間玩起了 "蹺蹺板"，一方增強，另一方就得 "讓步"。我們檢查了 IgG1 HC 和 LC mRNA 的表達，發(fā)現沒(méi)啥明顯變化，看來(lái) IgG1 產(chǎn)量下降，就是 cMYC 表達 "搞的鬼"！這些數據實(shí)打實(shí)地證明，cMYC 作為細胞生長(cháng)加速的 "靶點(diǎn)"，那是相當靠譜！和可誘導系統 "聯(lián)手" 后，就能輕松調控哺乳動(dòng)物細胞的生長(cháng)能力。我們還在 CHOK1IgG1 和 HEK293 細胞系里測試了 ABA-MYC 回路，結果都和之前的實(shí)驗 "對上了暗號"，活細胞密度增加，IgG1 產(chǎn)量減少，妥妥的 "實(shí)力認證"！

       圖3.開(kāi)發(fā)一種可編碼cMYC基因表達的脫落酸(ABA)誘導型基因回路，用于調控IgG1產(chǎn)生型抗死亡細胞系(CHOXK IgG1 -ABA-MYC)的對數生長(cháng)期。A ) 表達cMYC和mCherry基因的ABA-MYC回路示意圖，該回路在PhlF可激活啟動(dòng)子的作用下進(jìn)行，由最小CMV啟動(dòng)子上游的六個(gè)PhlF操縱子組成。ABA誘導空間分離的PYL1和ABI結構域二聚化，導致PhlF DNA結合結構域與VP16轉錄激活結構域結合，從而誘導基因表達。B) mCherry熒光表達。C)和D) cMYC分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平上的表達。E) 活細胞密度。F) 細胞活力曲線(xiàn)。G) 細胞周期分布。H) IgG1產(chǎn)量滴度。I) 細胞特異性生產(chǎn)力。 J) 和 K) 分別為 IgG1 HC 和 LC mRNA 的表達。(黑色) 未誘導對照，(粉色) 2.5 μM ABA，(紅色) 5 μM ABA 和 (深紅色) 10 μM ABA。(*)、(**)、(***) 和 (****) 分別表示p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（單因素方差分析）。實(shí)驗值代表三個(gè)生物學(xué)重復 (n = 3) 的平均值 ± SEM。

       誘導穩定期：給細胞按下 "暫停鍵" 的魔法

       哺乳動(dòng)物細胞的穩定期，就像細胞生長(cháng)路上的 "服務(wù)區"，到了這兒，細胞生長(cháng)直接 "踩剎車(chē)"。這一階段的開(kāi)啟，可能是被各種內在、外在的 "刺激信號" 召喚來(lái)的。穩定期一到，細胞密度就 "躺平" 保持恒定，細胞周期蛋白也開(kāi)始 "調整工作模式"。對哺乳動(dòng)物細胞生物工藝來(lái)說(shuō)，穩定期可是個(gè) "香餑餑"，能大幅提升生產(chǎn)力。但尷尬的是，它常常是因為碰上營(yíng)養 "斷糧"、壓力 "爆表" 等糟糕環(huán)境才出現。所以，我們決定開(kāi)發(fā)一套 "魔法系統"，能按需誘導穩定期，還不折騰培養環(huán)境！

       為了精準控制細胞生長(cháng) "踩剎車(chē)"，我們圍繞 BLIMP1 基因設計了一套基因回路。BLIMP1 基因那可是細胞周期和細胞分化領(lǐng)域的 "大佬"，妥妥的 "主調節器"！我們借助 Tet-On rtTA/tTS 系統，搭建起 TET-BLIMP1 回路。這個(gè)回路就像一個(gè) "雙重保險" 調控框架：沒(méi)有四環(huán)素（TET）時(shí)，tTS 蛋白就像個(gè) "嚴厲的監工"，死死抑制目的基因（GOI）的表達；一旦 TET 出現，rtTA蛋白立刻 "變身"，成為激活基因表達的 "超級助推器"。tTS 蛋白是 TetR（Tet 阻遏蛋白）和 KRAB-AB（Kid1 蛋白的轉錄阻遏結構域）"合體" 而成，專(zhuān)門(mén)和 TRE 啟動(dòng)子 "綁定"，掐斷基因轉錄的 "電源"；rtTA 蛋白則是rTetR（TetR 突變體）和 VP16 的 "融合戰士"，在 TET 的 "召喚" 下，激活 TRE 啟動(dòng)子，讓 BLIMP1 基因和報告蛋白 GFP "閃亮登場(chǎng)"（見(jiàn)圖 4A）。這套雙重調控系統超 "靠譜"，幾乎不會(huì )出現 "表達泄漏"，對 TET 的響應也超靈敏！

       圖4.構建四環(huán)素 (TET) 誘導的編碼 BLIMP1 基因表達的基因回路，用于調控產(chǎn)生 IgG1 的抗死亡細胞系 (CHOXK IgG1 -TET-BLIMP1) 的穩定期。A ) TET-BLIMP1 回路示意圖，該回路在四環(huán)素 TREt 啟動(dòng)子下表達 cMYc 和 GFP 基因。TET 與 rtTA 結合后，誘導 TREt 啟動(dòng)子基因表達，該啟動(dòng)子由最小 CMV 啟動(dòng)子上游的六個(gè) TetO 序列組成。B) GFP 熒光表達。C) 和 D) BLIMP1 分別在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上的表達。E) 活細胞密度。F) 細胞活力曲線(xiàn)。G) 細胞周期分布。H) IgG1 產(chǎn)量滴度。I) 細胞特異性生產(chǎn)力。J) 和 K) 分別表示 IgG1 HC 和LC 的 mRNA 表達。（黑色）未誘導對照，（淺綠色）250 ng/mL TET，（綠色）500 ng/mL TET 和（深綠色）1000 ng/mL TET。（*）、（**）、（***）和（****）分別表示 p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（單因素方差分析）。實(shí)驗值代表三個(gè)生物學(xué)重復（n = 3）的平均值±SEM。

       我們把 TET 誘導回路整合進(jìn) CHOXKIgG1 細胞系，培育出穩定細胞系，這樣就能用培養基里的 TET，像調節燈光亮度一樣，精準調控 BLIMP1 的表達。實(shí)驗時(shí)，往培養基里加 TET，TET-BLIMP1 回路立馬 "開(kāi)工"，對 BLIMP1 和 GFP基因的調控效果，在 mRNA 和蛋白質(zhì)水平都清晰可見(jiàn)（見(jiàn)圖 4B、C 和 D）。BLIMP1 一被激活，細胞生長(cháng)和 IgG1 產(chǎn)量就開(kāi)始 "大變樣"，而且變化程度和 TET 濃度 "鎖死"，完美對應。隨著(zhù) TET 濃度升高，細胞密度就像泄了氣的氣球，逐漸下降（見(jiàn)圖 4E）。和 ABA-MYC 回路激活類(lèi)似，TET-BLIMP1 回路激活后，細胞活力也 "支棱" 起來(lái)了，這大概是因為細胞數量少了，對 "糧草" 的需求也跟著(zhù)降低。BLIMP1 讓細胞生長(cháng) "踩剎車(chē)"，細胞周期也跟著(zhù) "停車(chē)"：G1 期細胞數量 "暴增"，G2 期細胞數量 "暴跌"，S 期依舊 "淡定"（見(jiàn)圖 4G）。在 CHOXK IgG1 細胞里，誘導 BLIMP1 簡(jiǎn)直像給細胞裝上了 "生產(chǎn)力加速器"，IgG1 滴度飆升 2.1 倍，細胞特異性生產(chǎn)力更是猛增 10 倍（見(jiàn)圖 4H 和 I）！和 ABA-MYC 回路激活的效果一對比，簡(jiǎn)直是 "冰火兩重天"，這也實(shí)錘了哺乳動(dòng)物細胞的生產(chǎn)能力和增殖能力之間的 "愛(ài)恨情仇"。我們分析了 HC 和 LC 的 r-IgG1 轉錄本的 mRNA 表達，發(fā)現沒(méi)啥變化，看來(lái) IgG1 產(chǎn)量增加，就是 BLIMP1 "搞的好事"！這些數據充分說(shuō)明，BLIMP1 就是誘導生長(cháng)停滯、提升細胞生產(chǎn)力的 "潛力股"！和可靠的誘導系統"組隊" 后，就能讓細胞生長(cháng)穩穩 "減速"，順利進(jìn)入早期穩定期，把哺乳動(dòng)物細胞的生產(chǎn)力拉到 "滿(mǎn)格"！我們又在 CHOK1IgG1 細胞和 HEK293 細胞里測試了 TET-BLIMP1 回路，結果依舊 "穩如老狗"，活細胞密度下降，IgG1產(chǎn)量增加，完美 "復刻" 之前的實(shí)驗結果！

       雙重可控系統：細胞生長(cháng)的 "智能遙控器"

       前面我們成功開(kāi)發(fā)出了調控哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)階段的 "秘密武器"，能減緩細胞死亡、加速生長(cháng)期、誘導穩定期，ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 回路也用實(shí)力證明，它們能各自 "獨當一面"，精準控制細胞的生長(cháng)期和穩定期。但生物工藝這事兒，可比想象中復雜多了，光有 "單打獨斗" 可不行，還得能實(shí)現動(dòng)態(tài)調控，才能讓細胞發(fā)揮出最佳 "戰斗力"！想要把這些工具的潛力全挖出來(lái)，用在哺乳動(dòng)物細胞生物工藝上，就得像操控智能家電一樣，能精細調節、協(xié)調細胞的生長(cháng)期和穩定期！

       說(shuō)干就干！我們開(kāi)發(fā)出了一個(gè) "雙重可控平臺"，把 ABA-MYC 和 TET-BLIMP1回路都 "打包" 整合到抗死亡 CHOXKIgG1 細胞系里（見(jiàn)圖 5A）。整合完 ABA-MYC 回路的細胞，再 "喂" 上 TET-BLIMP1 回路，接著(zhù)走細胞系開(kāi)發(fā)流程，又是抗生素篩選，又是基于 FACS 的限制稀釋克隆，最后進(jìn)行單克隆選擇，一頓操作猛如虎！為了檢驗 ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 系統的 "雙人配合" 能力，我們通過(guò)分析熒光 mCherry 和 GFP 報告基因的表達，測試它們對誘導物的 "敏感度"。結果超驚喜！整合了兩種基因回路的細胞，對相應誘導物那叫一個(gè) "專(zhuān)一"，往培養基里分別加 ABA 和 TET，mCherry 和 GFP 立馬 "亮燈" 表達（見(jiàn)圖 5B 和 C），妥妥的 "指哪打哪"！

       圖 5.哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)期和穩定期的雙重可控系統。A ) 控制 cMYC（決定生長(cháng)期）和 BLIMP1（決定穩定期）表達的正交遺傳回路示意圖。B) 和 C) 分別在存在和不存在A(yíng)BA 和 TET 誘導物的情況下的 mCherry 和 GFP 熒光。D) 活細胞密度曲線(xiàn)。E)細胞特異性生長(cháng)率。F) 細胞活力曲線(xiàn)。G) IgG1 產(chǎn)生。H) 細胞特異性生產(chǎn)力。（黑色）對照條件：CHOXK IgG1 -ABA-MYC/TET-BLIMP1加 2% DMSO，（紫色）誘導條件 CHOXK IgG1 -ABA-MYC/TET-BLIMP1 加ABA 和 TET 分別用于生長(cháng)期和穩定期。生長(cháng)期（以cMYC激活定義）是通過(guò)在第2、4和6天用5 μM ABA誘導ABA-MYC回路實(shí)現的。穩定期（以BLIMP1激活定義）是通過(guò)在第7、10和12天用1 μM TET誘導TET-BLIMP1回路實(shí)現的。(*)、(**)、(***)和(****)分別表示p < 0.05、0.01、0.001、0.0001（二向方差分析）。實(shí)驗值代表三次生物學(xué)重復（n = 3）的平均值±SEM。

       為了測試這套雙重可控系統在實(shí)際培養環(huán)境中的 "真本事"，我們制定了一套雙相生物處理策略。第一階段先激活 ABA-MYC 回路，給細胞生長(cháng) "踩油門(mén)"；等細胞 "跑" 起來(lái)了，再激活 TET-BLIMP1 回路，讓細胞 "穩穩停車(chē)"。在生長(cháng)加速階段，激活 ABA-MYC 回路的細胞，就像裝上了 "渦輪增壓器"，細胞密度 "唰唰" 往上漲，細胞特異性生長(cháng)率也把未誘導細胞遠遠甩在身后，最高能達到約 18 x 10^6 cells/mL，比未誘導細胞多出 80%（見(jiàn)圖 5）！在 rIgG1產(chǎn)量方面，誘導細胞和未誘導細胞的生產(chǎn)曲線(xiàn) "神同步"，誘導細胞的產(chǎn)量還略勝一籌，但細胞特異性生產(chǎn)力沒(méi)啥差別。不過(guò)，和只表達 ABA-MYC 回路的細胞相比，我們這套雙系統在生產(chǎn)力結果上卻 "鬧起了分歧"。仔細一琢磨，問(wèn)題可能出在基于 FACS 的克隆選擇過(guò)程：當時(shí)為了選出 mCherry 和 GFP 表達都 "爆表" 的細胞群體，兩個(gè)系統同時(shí)激活，結果一不小心，可能選出了一個(gè)被 BLIMP1 "暗中加持"、能力超強的克隆。這也提醒我們，這兩個(gè)調控系統之間的 "互動(dòng)" 太復雜，得好好研究，優(yōu)化選擇過(guò)程，才能讓調控更穩、更準！

       到了第二階段，我們把加了 ABA 的 "舊培養基" 換成加了 TET 的 "新套餐"，還把誘導和未誘導細胞的初始濃度都調成約 8 x 10^6 cells/mL，保證公平 "競技"。這時(shí)候激活 TET-BLIMP1 回路，細胞立馬 "急剎車(chē)"，生長(cháng)停滯，細胞特異性生長(cháng)速率 "斷崖式下跌"，穩穩進(jìn)入穩定期（見(jiàn)圖 5D 和 E）。BLIMP1 讓細胞密度降低的同時(shí)，還順手 "奶" 了一口細胞活力，和只整合 TET-BLIMP1 回路的細胞反應一模一樣。在產(chǎn)物生產(chǎn)方面，TET 誘導的細胞直接 "開(kāi)大"，IgG1 產(chǎn)量和細胞特異性生產(chǎn)力 "原地起飛"，產(chǎn)物滴度暴增 3.2 倍，qP 提升 2.1 倍！

       總的來(lái)說(shuō)，我們成功讓抗死亡細胞系同時(shí) "搭載" ABA-MYC 和 TET-BLIMP1 通路，而且完全沒(méi)有 "表達泄漏"！用獨立的小分子誘導劑，就能像操控遙控器一樣，精準調控細胞的生長(cháng)期和穩定期。這些成果充分說(shuō)明，用多層次基因工程方法，在培養過(guò)程中調控哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)階段，這事兒絕 對 "有戲"！

       討論

       在細胞研究的江湖里，各路高手都在琢磨怎么拿捏哺乳動(dòng)物細胞的 "成長(cháng)密碼"，而我們這次帶來(lái)了堪稱(chēng) "王炸" 的全面細胞工程策略！這就好比給細胞量身定制了一套超牛的成長(cháng)指南，精準把控它們的生長(cháng)節奏，直接優(yōu)化生物工藝性能，讓細胞們 "打工" 更賣(mài)力。

       以前也有不少研究，就像給細胞打了 "興奮劑"，通過(guò)組成性過(guò)表達控制生長(cháng)或抑制細胞凋亡的靶點(diǎn)，成功讓細胞在不同生長(cháng)階段 "聽(tīng)話(huà)"。但咱這次玩的是 "高端局"，別人都是單打獨斗，我們直接對哺乳動(dòng)物細胞系進(jìn)行多重工程改造，就像給細胞裝上了三頭六臂，能同時(shí)對三個(gè)培養階段進(jìn)行 "顯微鏡級" 的精細控制！

       在這項研究里，我們展示了組合細胞工程方法的 "神仙操作"。一方面，用 CRISPR/Cas9 這把 "基因剪刀"，咔嚓一下敲除促凋亡蛋白，直接掐滅細胞死亡的 "小火苗"；另一方面，在小分子誘導系統的 "指揮" 下，精準控制外源cMYC 和 BLIMP1 基因的表達，讓細胞生長(cháng)變得像踩油門(mén)剎車(chē)一樣隨心所欲。這兩招一結合，就像是給細胞裝上了智能導航，能精準調控細胞狀態(tài)。想象一下，哺乳動(dòng)物細胞就像一個(gè)個(gè)小小的 "生產(chǎn)車(chē)間"，我們這套方法就是給車(chē)間升級了設備，能大大提高具有商業(yè)價(jià)值的重組產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)間和規模的精準度，讓這些 "車(chē)間" 產(chǎn)出翻倍！

       說(shuō)到這里，得好好嘮嘮我們的 "獨門(mén)秘籍"-- 把細胞調控系統比作汽車(chē)發(fā)動(dòng)機。細胞生長(cháng)的調控就像給發(fā)動(dòng)機裝上了 "油門(mén)和剎車(chē)踏板"，想加速就踩油門(mén)，想減速就踩剎車(chē)，精準度、靈活性和可操作性直接拉滿(mǎn)！而減少細胞死亡，就好比給細胞系系上了安全帶，裝上了安全氣囊，讓培養的哺乳動(dòng)物細胞在 "成長(cháng)道路" 上穩如泰山，再也不怕 "翻車(chē)"。

       細胞凋亡可是哺乳動(dòng)物細胞培養中的 "頭號殺手"，專(zhuān)門(mén)搞破壞。不過(guò)別慌，當cMYC 和 / 或 BLIMP1 表達被誘導時(shí)，減弱細胞凋亡就成了超厲害的 "安全衛士"，能把凋亡信號的 "攻擊" 擋在門(mén)外。我們的數據也超給力，雙 Bak 和 Bax KO 就像兩個(gè)勇猛的 "基因戰士"，通過(guò)下調下游凋亡信號通路（Caspase3、7 和 9），有效減輕細胞死亡，直接延長(cháng)了細胞的 "壽命" 和活力，就像給細胞打了 "續命針"。而且就算對這些 "抗死亡細胞系" 再進(jìn)行基因操作，它們依然能 "堅守崗位"，抗死亡表型韌性十足，堪稱(chēng)細胞界的 "小強"！這和之前的研究結果也對上了，之前就有研究發(fā)現，同時(shí)敲除 Bak 和 Bax 或過(guò)表達抗凋亡蛋白，也能讓細胞活力大增，看來(lái)我們這次是找對 "路子" 了！

       再來(lái)說(shuō)說(shuō)我們開(kāi)發(fā)的 "油門(mén)和剎車(chē)踏板" 系統，這可是 "師出有名"，借鑒了B 細胞和漿細胞固有的調節機制。經(jīng)過(guò)實(shí)戰檢驗，它調節哺乳動(dòng)物細胞生長(cháng)率的能力那是杠杠的！cMYC 驅動(dòng)的油門(mén)踏板就像個(gè) "急性子"，靈活性和響應能力滿(mǎn)分，在標準批次設置范圍內，能讓活細胞密度 "嗖" 地一下就沖到和補料分批培養相似的水平，簡(jiǎn)直是細胞生長(cháng)的 "加速器"。這也讓我們看到了設計基因組整合系統的巨大潛力，以后說(shuō)不定能減少對昂貴的富集培養基 / 補料的依賴(lài)，給生物工藝 "降本增效"！

       而基于 BLIMP1 的剎車(chē)踏板也不甘示弱，它就像個(gè) "穩壓器"，能提前讓細胞進(jìn)入穩定期，而且不受特定培養基成分消耗的影響，想讓細胞 "剎車(chē)" 就 "剎車(chē)"。這個(gè)穩定期誘導系統不僅能根據細胞特性定制生產(chǎn)力，還能把細胞生產(chǎn)生物制藥的潛力全都 "榨" 出來(lái)。要是這兩個(gè)系統聯(lián)手，那就是 "王炸組合"，能全方位控制培養中哺乳動(dòng)物細胞的行為和表型。我們開(kāi)發(fā)的雙控細胞系，就像給細胞安排了一場(chǎng) "速度與激情" 的旅程，先踩油門(mén)讓細胞快速生長(cháng)，再踩剎車(chē)進(jìn)入減速階段，在整個(gè)培養過(guò)程中充滿(mǎn)了變數和驚喜，還能精準控制哺乳動(dòng)物細胞的關(guān)鍵性能參數。雖然我們只展示了一種潛在模式，但在補料分批培養和連續培養模型里，還有超多 "隱藏玩法" 等著(zhù)我們去解鎖！

       把目光放長(cháng)遠，這套系統的應用前景那可是一片光明！我們完全可以定制類(lèi)似的系統，讓它去 "征服" 各種各樣的生物功能，解決不同的生物工藝挑戰。想象一下，開(kāi)發(fā)出能在特定培養階段減輕氧化或內質(zhì)網(wǎng) (ER) 應激的系統，就像給細胞請了 "私人保鏢"，專(zhuān)門(mén)應對各種 "危險"，這簡(jiǎn)直就是多因素生物工藝障礙的 "萬(wàn)能鑰匙"！我們還打算為 r 生物藥物建立精確的可誘導基因表達系統，讓它能 "察言觀(guān)色"，根據特定的培養階段做出反應。這樣就能在細胞生產(chǎn)力最大化的培養階段，專(zhuān)門(mén)激活 r 基因的表達，給細胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程 "減負"，再也不用讓基因一直 "加班" 了。不管是單獨使用這些 "黑科技"，還是讓它們組團 "出戰"，都是為了讓細胞在復雜的生物工藝環(huán)境中，變得更 "抗造"、更能 "打"！

       不過(guò)話(huà)說(shuō)回來(lái)，我們提出的這種創(chuàng )新方法，雖然給擴大哺乳動(dòng)物細胞平臺規模帶來(lái)了新希望，那些 ABA 或 TET 等小分子誘導的遺傳回路也很強大、靈活，但它們想 "進(jìn)軍" 工業(yè)界，還得好好 "考核" 一番。誘導系統確實(shí)是調整細胞性能的 "得力助手"，能從細胞內部實(shí)現工藝強化，甚至賦予細胞新功能，讓工藝過(guò)程更靠譜。但它也有 "小毛病"，對小分子誘導劑的依賴(lài)可能會(huì )增加生物藥物的生產(chǎn)成本，而且在下游工藝中去除這些分子也是個(gè) "老大難" 問(wèn)題。

       別擔心，我們早就想好 "對策" 了！我們建議應用基于內源性調節機制的 "油門(mén)和剎車(chē)踏板" 控制。未來(lái)可以探索使用特定啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子就像細胞里的"智能開(kāi)關(guān)"，能在特定生長(cháng)階段或響應特定環(huán)境信號（比如細胞內代謝物或溫度）時(shí)自動(dòng)激活，替代小分子誘導劑。最近的研究也給我們 "打了氣"，利用低溫條件引導細胞系向特定表型進(jìn)化，說(shuō)不定能成為新的突破口。這些策略要是成功了，就能設計出超智能的遺傳回路，讓細胞自己根據培養環(huán)境變化做出反應，徹底擺脫對小分子的依賴(lài)，為細胞系開(kāi)發(fā)和工藝優(yōu)化打開(kāi)新世界的大門(mén)！

       當然，想要這套系統在生物生產(chǎn)領(lǐng)域 "大展拳腳"，還有不少 "關(guān)卡" 要闖。為了展示 "油門(mén)和剎車(chē)踏板" 方法的原理，我們在簡(jiǎn)單的批次培養條件下做了研究，這樣能更清楚地評估工程基因回路對細胞生長(cháng)和生產(chǎn)力的影響，不受補料分批條件下培養環(huán)境變化的干擾。但我們也知道，生物制藥生產(chǎn)的 "行業(yè)頂流"是強化補料、優(yōu)化補料方案，還有連續灌流培養系統。所以研究這套方案在補料分批和灌流系統中的適用性，就是我們接下來(lái)的 "重頭戲"。特別是灌流系統，工程細胞平臺的長(cháng)期穩定性是關(guān)鍵，工業(yè)應用需要對生產(chǎn)和表型穩定性進(jìn)行 "魔鬼測試"，通常得讓細胞傳代培養超過(guò) 100 天，還要仔細評估培養性能參數。只有通過(guò)了這項測試，才能保證在工業(yè)細胞系開(kāi)發(fā)過(guò)程中，產(chǎn)量穩定又可靠！

       為了讓這套系統更 "完美"，我們還瞄準了兩個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域。第一個(gè)領(lǐng)域是優(yōu)化細胞生長(cháng)和生產(chǎn)之間的平衡，就像在走鋼絲，要找到那個(gè) "完美支點(diǎn)"，提高整體產(chǎn)品產(chǎn)量。我們打算用實(shí)驗設計 (DoE) 方法，就像給細胞做 "排列組合游戲"，系統地探索不同的誘導劑濃度和誘導時(shí)間，精準微調細胞生長(cháng)和生產(chǎn)率之間的平衡，實(shí)現高細胞密度和高生產(chǎn)率的 "雙贏(yíng)"！第二個(gè)領(lǐng)域是提高重組蛋白的產(chǎn)量，我們要在細胞生產(chǎn)率最大化的培養階段，專(zhuān)門(mén)定制轉基因表達，給細胞 "開(kāi)小灶"，減輕組成型表達的代謝負擔，讓復雜分子的產(chǎn)量 "蹭蹭" 往上漲。這些研究要是順利，就能助力我們的新型細胞平臺從 "實(shí)驗室明星" 成功轉型為 "工業(yè)生產(chǎn)主力"！

       雖然這套系統在 r - 單克隆抗體上已經(jīng) "大顯身手"，但它和其他 IgG 型分子（比如 Fc 融合蛋白或多特異性抗體）能不能 "友好相處"，還是個(gè)未知數。而且它能不能攻克低滴度高度復雜蛋白質(zhì)生產(chǎn)的難關(guān)，也值得我們在未來(lái)好好探索一番。不過(guò)總的來(lái)說(shuō)，這項研究讓我們看到了合成生物學(xué)工具和組合工程方法的無(wú)限潛力，說(shuō)不定未來(lái)真能開(kāi)發(fā)出高度可控的哺乳動(dòng)物細胞工廠(chǎng)，讓細胞們成為生物生產(chǎn)領(lǐng)域的 "超級工人"！

       原文：M. Torres, D. Mcconnaughie, S. Akhtar, et al., Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metabolic Engineering, 2024.