嵌合抗原受體（CAR）-T細胞療法已顯示出強大的治愈潛力，并成為一系列B細胞惡性腫瘤治療的關(guān)鍵組成部分。CAR-T細胞療法成功用于治療血液癌和實(shí)體癌以及自身免疫性疾病等其他適應癥，取決于有效的CAR-T細胞生產(chǎn)，這不僅會(huì )影響產(chǎn)品的安全性和有效性，還會(huì )影響有需要的患者的整體可及性。這篇綜述討論了自體CAR-T細胞生產(chǎn)的主要工藝參數，以及監管考慮因素和正在進(jìn)行的發(fā)展，這些因素將使下一代CAR-T細胞療法成為可能。

       【NO.1】介紹

       文中描述了幾種FDA批準的CAR-T細胞產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝，具有廣泛的相似性和獨特性（表1）。整個(gè)過(guò)程包括從白細胞分離法產(chǎn)物中分離起始細胞群、T細胞活化、基因修飾、離體擴增、最終產(chǎn)品配方和產(chǎn)品放行測試（圖1）。本綜述旨在概述每個(gè)關(guān)鍵生產(chǎn)步驟中的工藝參數如何影響所得細胞產(chǎn)品，并討論有可能在治療效果和患者可及性方面顯著(zhù)改變CAR-T細胞療法格局的下一代生產(chǎn)策略。

       表1.FDA批準的CAR-T細胞產(chǎn)品生產(chǎn)總結

       【NO.2】選擇起始細胞群

       選擇CAR-T細胞生產(chǎn)的起始細胞群是一個(gè)早期決策點(diǎn)，對生產(chǎn)過(guò)程和最終產(chǎn)品有重大影響。自體CAR-T細胞生產(chǎn)過(guò)程通常從純化形式的成熟T細胞開(kāi)始，或作為外周血單核細胞（PBMC）群體的一部分。成熟T細胞從初始（TN）表型分化為干細胞記憶（TSCM）、中樞記憶（TCM）、效應記憶（TEM）、效應（TE）和耗竭（TEXH）細胞。此外，T細胞可分為CD8+細胞毒性T細胞、CD4+輔助性T細胞和CD4+調節性T細胞。在輔助性T細胞類(lèi)別中，可以進(jìn)一步識別亞群，例如Th1、Th2、Th17和濾泡輔助細胞。T細胞表型的多樣性使起始細胞群的選擇成為CAR-T細胞生產(chǎn)中的主要工藝參數。然而，生物學(xué)并不是影響起始材料選擇的唯一因素，因為患者的臨床病史和健康狀況也對可以獲得的細胞生產(chǎn)材料施加了實(shí)際限制。

       圖1.自體CAR-T細胞生產(chǎn)過(guò)程示意圖，自體CAR-T細胞生產(chǎn)通常涉及初始細胞分離、T細胞活化、CAR轉基因（或mRNA）的引入、細胞擴增和最終制劑。大多數產(chǎn)品在輸注到患者體內之前在床邊冷凍保存和解凍。傳統的制造工藝通常涉及1-2周的離體細胞作和擴增，而簡(jiǎn)化的制造工藝可以將離體時(shí)間縮短到24-72小時(shí)。然而，由于運輸、產(chǎn)品放行測試和患者臨床護理考慮所需的時(shí)間，實(shí)際的靜脈到靜脈時(shí)間可能會(huì )長(cháng)得多。

       【NO.3】CD4+與CD8+T細胞

       CAR-T細胞通過(guò)CAR抗原結合直接激活，無(wú)需輔助受體與MHC分子結合。因此，CAR-T細胞功能原則上不需要CD4和CD8分子作為輔助受體。CAR-T細胞的早期開(kāi)發(fā)工作考慮了選擇性富集CD8+T細胞以最大限度地提高細胞毒性的優(yōu)勢。然而，CD4+輔助性T細胞在促進(jìn)CD8+T細胞的效應功能、擴增和持久性方面也起著(zhù)關(guān)鍵作用，并且已經(jīng)表明CD4+T細胞在腫瘤微環(huán)境中的存在導致CD8+細胞毒性T細胞的募集、增殖和功能增加。因此，目前批準的CAR-T細胞產(chǎn)品都含有CD4+和CD8+T細胞，盡管采用了不同的生產(chǎn)方法。

       細胞分離通常通過(guò)基于磁珠的細胞分選來(lái)實(shí)現。CD4+和CD8+細胞的混合物可以通過(guò)去除非T細胞或使用CD4和CD8結合微珠的組合進(jìn)行陽(yáng)性選擇來(lái)分離。分離混合T細胞群的過(guò)程相對簡(jiǎn)化，與平行生產(chǎn)單獨的CD4+和CD8+細胞培養物相比，可以以更低的成本完成，但它排除了在最終產(chǎn)品中精確控制CD4：CD8比率的可能性?；蛘?，CD4+和CD8+T細胞可以單獨分離和培養，從而可以配制具有精確CD4：CD8比率的最終產(chǎn)品。但是，這種方法的代價(jià)是增加勞動(dòng)力、時(shí)間和生產(chǎn)成本。此外，最佳的CD8+T細胞擴增需要CD4+T細胞的存在，這使得分離的CD8+T細胞的生產(chǎn)容易出現生產(chǎn)失敗。應對這一挑戰的一個(gè)潛在解決方案是分別分離CD4+和CD8+T細胞，但以規定的起始比例共培養，目的是產(chǎn)生具有大致所需比例的CD4：CD8T細胞的最終細胞產(chǎn)品。這種策略已被證明可以克服CD8+T細胞擴增的困難，導致與單獨培養的CD4+和CD8+T細胞相比，小鼠的產(chǎn)物具有更高的細胞毒功能。然而，這種"定義"的生產(chǎn)方法并不能完全防止生產(chǎn)失敗。重要的是，在產(chǎn)品中產(chǎn)生所需的最終比例所需的起始CD4：CD8比率可能因供體而異，因此這種方法仍然難以實(shí)現精確的產(chǎn)品特征。

       【NO.4】T細胞分化狀態(tài)

       除了CD4：CD8比率之外，T細胞產(chǎn)物的分化狀態(tài)已被證明與抗腫瘤療效特征相關(guān)。在抗原刺激后，T細胞經(jīng)歷克隆擴增，一個(gè)亞群分化成TE細胞，TE細胞具有強大的細胞毒性和細胞因子產(chǎn)生能力，但壽命相對較短，相比之下，活化的T細胞亞群變成記憶T細胞，這些細胞壽命長(cháng)，響應繼生抗原攻擊而迅速激活。與終末分化的TE細胞相比，TN、TSCM和TCM細胞具有更大的長(cháng)期持續潛力并產(chǎn)生較低水平的炎性細胞因子，它們可以共同實(shí)現持久的抗腫瘤反應，同時(shí)避免嚴重的急性毒性，如細胞因子釋放綜合征（CRS）。這些發(fā)現支持了對從富集幼稚和記憶T細胞開(kāi)始的生產(chǎn)過(guò)程的探索，早期證據表明此類(lèi)產(chǎn)品可以實(shí)現強大的療效和良好的安全性。

       CD45RA、CD45RO、CD62L和CCR7的表面表達通常用于識別T細胞亞型，并且可以通過(guò)選擇CD62L+細胞從白細胞去除術(shù)產(chǎn)物中分離出幼稚和記憶T細胞。然而，CD62L+選擇可同時(shí)導致同樣表達CD62L的CD14+髓系細胞和CD25+Treg的意外富集。髓系細胞已被證明會(huì )顯著(zhù)降低T細胞活化和隨后的病毒轉導的效率，這可能是由于用于激活T細胞的抗CD3/CD28磁珠的吞噬作用。此外，據報道，CAR-T產(chǎn)品中存在Tregs與抗腫瘤療效差相關(guān)。這些發(fā)現表明，CAR-T產(chǎn)品可能受益于CD14+和CD25+細胞類(lèi)型在CD62L+細胞富集之前耗盡，并且在多項臨床試驗（例如，NCT02208362和NCT04007029）中評估了使用CD14-/CD25-/CD62L+細胞作為CAR-T細胞生產(chǎn)的起始材料。

       出乎意料的是，一項試驗（NCT04007029）的數據顯示，在CD62L富集之前未耗盡CD14+和CD25+細胞的起始群體制成的CAR-T細胞產(chǎn)物與由CD14/CD25耗盡的起始群體制成的產(chǎn)品相比，具有相似的活化、轉導、擴增和最終CD3+純度水平。由非CD14/CD25耗盡細胞制成的產(chǎn)品在細胞生產(chǎn)結束時(shí)顯示CD4+T細胞中明顯富集，但基于該1期試驗中的少量患者，由CD14/CD25耗盡或未耗盡起始細胞群制成的細胞產(chǎn)品之間未觀(guān)察到治療結果的顯著(zhù)差異。值得注意的是，該特定臨床試驗中使用的細胞生產(chǎn)過(guò)程使用聚合物納米基質(zhì)T細胞興奮劑而不是基于磁珠的激活試劑，并且髓系細胞對不同大小和剛度的激活試劑表現出的差異吞噬反應可能在所得細胞產(chǎn)物的行為中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

       【NO.5】T細胞活化方法

       T細胞活化對于細胞生產(chǎn)過(guò)程的成功至關(guān)重要，因為它直接影響CAR轉基因整合的效率以及離體培養期間的T細胞擴增。T細胞活化通常是通過(guò)刺激CD3和CD28結合細胞因子支持來(lái)實(shí)現的。CD3信號傳導（信號1）觸發(fā)T細胞活化，而CD28信號傳導提供必要的共刺激（信號2）以避免無(wú)反應。此外，細胞因子混合物（信號3）--最常見(jiàn)的是IL-2、IL-7和/或IL-15--用于支持T細胞擴增。目前，生產(chǎn)方案通常使用涂有抗CD3和抗CD28抗體的磁珠或膠體聚合物納米基質(zhì)來(lái)提供信號1和2。磁珠提供固體支持，模擬呈遞肽-MHC復合物和共刺激配體的靶細胞以進(jìn)行T細胞結合，抗CD3/CD28磁珠可同時(shí)用作基于磁性的細胞分選的T細胞分離劑。然而，磁珠容易被髓細胞吞噬，因此使用抗CD3/CD28珠子進(jìn)行細胞分選存在CD14+細胞富集的風(fēng)險，同時(shí)減少了可用于刺激T細胞的激活試劑的數量。此外，在回輸之前，需要通過(guò)磁分離進(jìn)行去珠步驟以生成純CAR-T細胞產(chǎn)物。相比之下，膠體聚合物納米基質(zhì)似乎不太容易被髓系細胞消除，并且可以通過(guò)簡(jiǎn)單的離心去除。然而，尚未報道這些試劑的頭對頭比較，無(wú)法對所得細胞產(chǎn)物進(jìn)行嚴格比較。

       無(wú)論形式如何，市售活化劑都是以固定磁珠：細胞比例或每體積稀釋比例應用的標準化產(chǎn)品。最近的發(fā)展探索了根據患者的疾病類(lèi)型為每種產(chǎn)品量身定制的個(gè)性化T細胞活化試劑的可能性。例如，利用涂有脂質(zhì)雙層的介孔二氧化硅微棒，Mooney及其同事開(kāi)發(fā)了APC模擬支架，該支架不僅可以提供抗CD3和-CD28信號，還可以實(shí)現IL-2的持續釋放?？梢跃_調整抗CD3和-CD28抗體的密度，以提供最佳刺激強度，從而最大限度地提高T細胞適應性。實(shí)施經(jīng)過(guò)微調、高度個(gè)性化的試劑必須與生產(chǎn)通量和工藝穩健性的實(shí)際考慮相平衡。盡管如此，可以適應不同產(chǎn)品要求的"智能"材料的出現可以顯著(zhù)提高生產(chǎn)過(guò)程的靈活性和質(zhì)量。

       應該注意的是，盡管T細胞活化是當今CAR-T細胞生產(chǎn)中不可或缺的步驟，但下一代生產(chǎn)工藝正在考慮消除T細胞活化的可能性。例如，最近的一份報告描述了慢病毒載體成功轉導未活化的T細胞。

       【NO.6】CAR轉基因

       CAR轉基因遞送方法可以顯著(zhù)影響CAR轉基因表達水平以及遺傳毒性，進(jìn)而影響所得CAR-T細胞產(chǎn)品的安全性和有效性。在本節中，我們廣泛評估了CAR-T細胞生產(chǎn)的病毒和非病毒基因遞送方法。

       6.1病毒基因遞送

       目前，所有FDA批準的CAR-T細胞產(chǎn)品都使用慢病毒或逆轉錄病毒轉導來(lái)實(shí)現CAR轉基因整合。病毒轉導受益于相對較高的整合效率，表達穩定整合的CAR構建體的T細胞已被證明在T細胞輸注后持續>10年。然而，病毒整合的轉基因缺乏插入位點(diǎn)特異性，存在插入誘變的理論風(fēng)險。一項全基因組分析研究比較了用γ逆轉錄病毒載體與慢病毒載體制成的CAR-T細胞產(chǎn)品中的轉基因整合位點(diǎn)，結果表明，與逆轉錄病毒相比，慢病毒載體更有可能整合到內含子和基因間區域;相比之下，逆轉錄病毒整合到啟動(dòng)子、非翻譯區和外顯子區的頻率更高，導致對mRNA轉錄水平的影響更大。值得注意的是，迄今為止還沒(méi)有報道病毒整合導致CAR-T細胞致癌轉化的實(shí)例。相反，一項案例研究報告了一名患者，其對CD19CAR-T細胞療法的反應似乎與單個(gè)CAR-T細胞克隆的擴增相關(guān)，該克隆的CAR轉基因隨機插入TET2基因座，從而敲除唯一功能性的TET2拷貝，因為該患者在另一個(gè)TET2等位基因中具有先天性錯義突變。同樣，在B細胞急性淋巴細胞白血病患者（B-ALL）。盡管這些病例表明隨機插入可能會(huì )偶然導致積極的治療結果，但插入到不需要的基因座的風(fēng)險仍然是探索可以確保位點(diǎn)特異性的替代轉基因整合策略的動(dòng)機。

       除了整合位點(diǎn)的考慮外，病毒載體還以具有復制能力的逆轉錄病毒（RCR）和慢病毒（RCL）的形式存在另一種潛在風(fēng)險。因此，FDA要求對病毒載體以及病毒轉導的細胞產(chǎn)品進(jìn)行RCR/RCL檢測測定。然而，迄今為止，尚未在臨床CAR-T細胞產(chǎn)品中檢測到RCR和RCL的報道，并且平衡RCR/RCL測試造成的成本和潛在延遲與此類(lèi)分析的實(shí)際好處仍然是一個(gè)積極科學(xué)探索的話(huà)題。

       盡管病毒轉導原則上可以實(shí)現高轉導效率，但在患者細胞產(chǎn)品中實(shí)現一致水平的轉基因整合是一項技術(shù)挑戰。事實(shí)上，10%或更低的CAR陽(yáng)性率--基于轉導細胞在抗原暴露后將在體內擴增的前提設定的水平--作為臨床試驗中使用的細胞產(chǎn)品中轉導效率的最低閾值并不少見(jiàn)。為了最大限度地降低由于轉基因表達不良而導致生產(chǎn)失敗的風(fēng)險，生產(chǎn)方案可以結合轉導增強劑的使用，例如硫酸魚(yú)精蛋白、retronectin和泊洛沙姆。病毒轉導中的限速步驟是病毒顆粒最初附著(zhù)在細胞膜上，這一過(guò)程可以通過(guò)使用retronectin進(jìn)行逆轉錄病毒轉導和聚陽(yáng)離子（如硫酸魚(yú)精蛋白）進(jìn)行慢病毒轉導來(lái)促進(jìn)。聚陽(yáng)離子充當將病毒連接到細胞表面的靜電橋。然而，硫酸魚(yú)精蛋白對T細胞的毒性與提高轉導效率的好處相抵消。相比之下，retronectin不會(huì )導致T細胞毒性，但其使用僅限于逆轉錄病毒載體。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了具有更有利毒性特征的專(zhuān)有轉導增強劑，盡管它們的高成本和專(zhuān)有訪(fǎng)問(wèn)可能會(huì )阻礙廣泛使用。

       除了病毒轉導的生物學(xué)特性外，實(shí)際考慮也會(huì )影響病毒在CAR-T細胞生產(chǎn)中的使用。能夠生產(chǎn)臨床級病毒的認證設施數量仍然有限。因此，病毒生產(chǎn)所需的時(shí)間和財務(wù)成本可能成為研究藥物開(kāi)發(fā)和商業(yè)CAR-T細胞生產(chǎn)的瓶頸，突出了可能更靈活且更具成本效益的替代非病毒遞送系統的吸引力。

       6.2非病毒基因遞送

       在CAR-T細胞生產(chǎn)的背景下，已經(jīng)探索了幾種不同的非病毒基因遞送方法，包括CRISPR/Cas9、轉座子和mRNA轉染。CRISPR/Cas9作為一種有效的基因組修飾方法已被廣泛采用，其增強CAR-T細胞療法的潛力并未被忽視。為了實(shí)現位點(diǎn)特異性基因修飾，Cas9核酸酶與單向導RNA（sgRNA）復合，通過(guò)與sgRNA的序列互補性識別基因組DNA上的靶位點(diǎn)，并引入雙鏈DNA斷裂。接下來(lái)，通過(guò)編碼所需轉基因（例如CAR）和基因組切割位點(diǎn)的DNA模板之間的同源重組來(lái)促進(jìn)轉基因插入。

       指定轉基因整合位點(diǎn)的能力為工程化具有所需功能的T細胞開(kāi)辟了新的可能性。已經(jīng)通過(guò)計算確定了許多基因外"安全港"位點(diǎn)并進(jìn)行了實(shí)證測試，以支持T細胞的精確基因改造以實(shí)現治療功能。特別是，已經(jīng)表明CAR轉基因可以使用腺相關(guān)病毒載體作為同源定向修復模板有效地整合到編碼內源性TCRα鏈的TRAC基因座中。這種策略征用了響應T細胞激活狀態(tài)動(dòng)態(tài)控制TCR表達水平的內源性基因調控機制，數據表明所得的CAR-T細胞可能比病毒整合的CAR-T細胞更有效。此外，基于非病毒CRISPR/Cas9的基因編輯策略也被用于用腫瘤特異性TCR取代內源性TCR，從而能夠開(kāi)發(fā)高度個(gè)性化的T細胞療法。作為另一個(gè)例子，上述涉及TET2突變的案例研究激發(fā)了隨后對有意將CAR轉基因整合到TET2位點(diǎn)作為增強CAR-T細胞增殖和持久性的一種手段的評估。有趣的是，結果表明，TET2破壞對體內抗腫瘤療效的益處因表達的特定CAR構建體而異，這與CAR整合到TRAC基因座中的類(lèi)似發(fā)現相呼應，并強調了確定CAR轉基因最佳整合位點(diǎn)的非平凡性質(zhì)。

       除了促進(jìn)位點(diǎn)特異性轉基因整合外，CRISPR/Cas9還與病毒整合結合使用，以敲除不需要的內源性基因，同時(shí)非位點(diǎn)特異性整合編碼腫瘤靶向受體的轉基因。例如，第一個(gè)涉及CRISPR/Cas9編輯的T細胞的FDA批準的臨床試驗利用了一種生產(chǎn)工藝，該工藝用CRISPR/Cas9敲除PD-1和內源性TCR，同時(shí)慢病毒整合了靶向NY-ESO-1的轉基因TCR。值得注意的是，據觀(guān)察，輸注后PDCD1基因座突變的NY-ESOTCR表達細胞的頻率隨著(zhù)時(shí)間的推移而降低，這表明PD-1編輯的T細胞可能缺乏形成長(cháng)期記憶的能力。在另一項1期臨床研究中，CRISPR/Cas9用于敲除PD-1和TCRα鏈，同時(shí)慢病毒整合靶向間皮素的CAR。盡管兩項研究都顯示出可接受的安全性，但都沒(méi)有導致療效的顯著(zhù)改善，突出了持續改進(jìn)的必要性。此外，CRISPR/Cas9介導的雙鏈DNA斷裂帶來(lái)了意外基因組變化的重要風(fēng)險，需要仔細分析和質(zhì)量控制，最近的一項研究揭示了Cas9工程CAR-T細胞中染色體丟失的可能性。有趣的是，同一項研究觀(guān)察到，特定的作順序會(huì )影響染色體丟失的頻率，如果在T細胞被激活之前進(jìn)行Cas9介導的雙鏈斷裂，則可以減少染色體丟失的頻率。

       作為CRISPR/Cas9的替代品，轉座子也被用于實(shí)現CAR轉基因穩定整合到T細胞產(chǎn)品中。特別是，piggyBac和睡美人（SB）轉座子系統已在臨床環(huán)境中進(jìn)行了評估。轉座子系統執行"剪切和粘貼"過(guò)程，其中轉座酶與靶基因元件兩側的末端反向重復序列（即轉座子）結合，通過(guò)雙鏈DNA斷裂切除轉座子，并將轉座子重新整合到合適的基因組位點(diǎn)（例如，在SB轉座子的情況下，包含AT二核苷酸的回文序列）。通過(guò)這種方式進(jìn)行的轉基因整合不是位點(diǎn)特異性的，據報道，piggyBac轉座酶表現出類(lèi)似于逆轉錄病毒的優(yōu)先插入轉錄起始位點(diǎn)，再次增加了插入誘變的潛在風(fēng)險。在一項1期臨床試驗中，兩名接受piggyBac轉座子系統產(chǎn)生的同種異體CD19CAR-T細胞產(chǎn)品治療的患者患上了CAR-T細胞衍生的淋巴瘤，導致一人死亡。事后分析表明，惡性CAR-T細胞不包含轉基因插入已知的致癌位點(diǎn)，但顯示出多條染色體的顯著(zhù)拷貝數增加和丟失以及來(lái)自轉基因啟動(dòng)子的轉錄通讀。重要的是，導致惡性轉化的產(chǎn)物具有異常高的載體拷貝數（VCN），其中一種產(chǎn)物的VCN為25。相比之下，在沒(méi)有產(chǎn)品特定理由的情況下，FDA推薦的病毒轉導細胞產(chǎn)品的最大拷貝數為每個(gè)轉導細胞5個(gè)拷貝。

       消除致癌插入風(fēng)險的一種策略是避免編碼CAR的轉基因的穩定整合，而是從mRNA模板瞬時(shí)表達CAR。除了消除遺傳毒性的風(fēng)險外，mRNA的瞬時(shí)CAR表達也被探索為降低潛在毒性的一種手段，特別是當CAR靶向也存在于健康組織中的抗原時(shí)。編碼轉基因的mRNA模板通常通過(guò)電穿孔遞送到T細胞中，轉基因表達持續約1周，電穿孔后表達水平每天下降。因此，瞬時(shí)基因表達的潛在安全優(yōu)勢必須與治療的短暫性質(zhì)相平衡。臨床評估表明，mRNA編碼的CAR-T細胞是安全的，并且可以表現出抗腫瘤功效，但實(shí)現完全和持久的腫瘤控制的能力仍然是一個(gè)研究領(lǐng)域。

       【NO.7】離體細胞擴增

       一旦T細胞被修飾以表達CAR轉基因，產(chǎn)物必須擴增到足夠大的數量，以滿(mǎn)足給藥所需的劑量。此擴展期的持續時(shí)間因不同的方案而異，但典型的過(guò)程從T細胞活化到細胞收獲持續1-2周。擴增條件針對T細胞生長(cháng)進(jìn)行了優(yōu)化，具有細胞因子支持，如IL-2、IL-7和/或IL-15。雖然擴增期的主要目的是增加T細胞數量，但它也通過(guò)將非T細胞暴露于不如其他細胞類(lèi)型的培養條件來(lái)消除非T細胞，因此即使生產(chǎn)過(guò)程從混合PBMC開(kāi)始，也能產(chǎn)生高度富集的T細胞產(chǎn)品。除了細胞因子外，FBS等培養補充劑在支持T細胞擴增方面也起著(zhù)關(guān)鍵作用，盡管能夠實(shí)現更精確配方和降低人畜共患病原體風(fēng)險的確定培養基成分正在迅速取代FBS等成分。最后，最近的研究探索了使用各種藥物補充劑來(lái)促進(jìn)理想的T細胞表型并增強所得CAR-T細胞產(chǎn)品的治療潛力。例如，酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼已用于CAR-T細胞生產(chǎn)，以抑制CAR強直信號傳導（即在沒(méi)有抗原刺激的情況下的受體信號傳導），從而防止T細胞過(guò)早耗竭并增加CAR-T細胞功能。該策略用于生產(chǎn)靶向GD2的CAR-T細胞--已知這些細胞具有強烈的強直信號并表現出耗竭傾向--用于1期試驗，早期結果顯示多名H3K27M突變彌漫性中線(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者有顯著(zhù)改善。由于對參加該試驗的每位患者進(jìn)行了多劑量的CAR-T細胞給藥，因此關(guān)于達沙替尼是否能防止耗竭和/或實(shí)現持續T細胞功能的明確結論仍然難以捉摸。盡管如此，這個(gè)例子證明了藥理學(xué)調節CAR-T細胞生產(chǎn)過(guò)程以產(chǎn)生用于臨床轉化的功能性CAR-T細胞產(chǎn)品的可行性。

       【NO.8】產(chǎn)品放行測試

       利用CAR-T細胞在2017年治療血液系統惡性腫瘤方面的突破性成功，全球正在進(jìn)行1000多項活躍的CAR-T細胞臨床試驗，集中在北美和歐亞大陸。臨床研究的熱潮加深了對成功CAR-T細胞產(chǎn)品相關(guān)參數的理解。與任何擬議的療法一樣，尋求臨床評估的CAR-T細胞必須滿(mǎn)足與安全性、純度、效力、特性和穩定性相關(guān)的既定產(chǎn)品特性。所有FDA批準的CAR-T細胞產(chǎn)品使用以下指標的組合來(lái)衡量商品特征：

•        安全性：支原體、無(wú)菌、內毒素、殘留病毒試劑定量、活力和CAR轉基因定量
•        純度：T細胞純度、活力、殘留試劑定量、轉導效率和是否存在污染腫瘤細胞
•        效價(jià)：抗原刺激后轉導效果、活力、CAR表達、細胞毒性或細胞因子（如IFN-γ）的產(chǎn)生
•        鑒定：CAR表達、觀(guān)察外觀(guān)、清晰度、劑量和活力
•        穩定性：配方、運輸和儲存。

       FDA最近起草了CAR-T細胞產(chǎn)品的標準化期望。特別是，早期研究性新藥申請提交的批次放行標準不需要經(jīng)過(guò)驗證的效價(jià)測定和規格，但在生成支持生物制品許可申請的數據時(shí)必須包括此類(lèi)測定。

       根據正在進(jìn)行的臨床試驗和實(shí)際經(jīng)驗的積累數據，還提出了額外的參數，以推動(dòng)未來(lái)開(kāi)發(fā)更具可重復性、更有效和安全的治療方法。例如，鑒于證據表明分化較少、記憶樣表型較多的CAR-T產(chǎn)品更有可能實(shí)現持久的腫瘤清除，未來(lái)的商業(yè)產(chǎn)品可能會(huì )受益于設置一個(gè)功效特征指標，該指標指定產(chǎn)品中有利T細胞亞群的比例。然而，更改和收緊產(chǎn)品規格必須以嚴格的科學(xué)證據和基本的生物學(xué)理解為指導，以避免引發(fā)不必要的生產(chǎn)失敗，從而可能減少患者獲得治療的機會(huì )。

       在某些涉及非危及生命的批次放行標準（例如劑量、轉導功效、細胞因子產(chǎn)生水平或CAR表達）的產(chǎn)品失敗的情況下，在獲得必要的監管批準后，可以向患者施用不合格產(chǎn)品。在擴大訪(fǎng)問(wèn)方案中，患者收到了不合格的商業(yè)和臨床試驗產(chǎn)品，并經(jīng)歷了與接受標準產(chǎn)品治療的患者相當的臨床結果。在現實(shí)世界環(huán)境中積累CAR-T細胞產(chǎn)品的臨床經(jīng)驗對于了解哪些產(chǎn)品特性真正影響患者安全性和治療效果非常寶貴，并可能作為進(jìn)一步完善CAR-T細胞產(chǎn)品放行測試監管指南的指南。

       【NO.9】CAR-T細胞生產(chǎn)的下一代策略

       迄今為止討論的生產(chǎn)策略支持了迄今為止多種CAR-T細胞產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)，并展示了CAR-T細胞療法克服晚期惡性腫瘤的潛力。然而，FDA批準后CAR-T細胞療法的實(shí)際經(jīng)驗也凸顯了傳統細胞生產(chǎn)工藝的局限性，這些工藝通量低且資源密集，導致患者獲得可能挽救生命的療法的機會(huì )有限。截至2023年初，90%的MM患者出現疾病進(jìn)展，25%的患者在等待BCMA定向的CAR-T細胞產(chǎn)品插槽時(shí)死于疾病，在接受單采術(shù)之前等待時(shí)間從1到10個(gè)月不等。單采術(shù)后，細胞必須經(jīng)過(guò)往返生產(chǎn)地點(diǎn)的運輸、離體修飾和擴增以及嚴格的質(zhì)量控制測試。大多數患者需要橋接療法來(lái)對抗細胞生產(chǎn)過(guò)程中的進(jìn)一步臨床惡化，這可能導致出現與橋接相關(guān)不良反應的患者進(jìn)一步延遲輸注。

       即使在靜脈到靜脈期間沒(méi)有醫療并發(fā)癥的情況下，4-7%的患者也因生產(chǎn)失敗而無(wú)法接受他們的CAR-T細胞產(chǎn)品，風(fēng)險因素包括多線(xiàn)治療后患者T細胞的健康狀況降低和漫長(cháng)的生產(chǎn)過(guò)程本身。產(chǎn)品生產(chǎn)失敗后的治療選擇包括重復單采術(shù)或過(guò)渡到替代療法，盡管這兩種情況下的生存結果都很差?？偠灾?，導致生命損失的多種延誤來(lái)源強調了及時(shí)獲得CAR-T細胞產(chǎn)品的重要性。在這里，我們討論了正在開(kāi)發(fā)的下一代策略，以應對CAR-T細胞生產(chǎn)中的關(guān)鍵挑戰（表2）。

       表2.下一代CAR-T細胞生產(chǎn)策略

       9.1加速細胞生產(chǎn)

       為了應對CAR-T細胞生產(chǎn)中的這些挑戰，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了新策略來(lái)顯著(zhù)縮短細胞生產(chǎn)的持續時(shí)間，從而降低生產(chǎn)成本，生產(chǎn)造失敗的可能性和靜脈到靜脈的時(shí)間。這些下一代生產(chǎn)工藝可以在短短24小時(shí)內形成最終產(chǎn)品配方（圖1），從而有可能顯著(zhù)加快患者獲得治療的機會(huì )。大部分時(shí)間節省是由于離體擴增期的顯著(zhù)縮短，從而限制了可以實(shí)現的細胞計數的倍數增加。然而，離體細胞分裂次數的減少也可能導致T細胞群分化程度降低，輸注后具有更大的長(cháng)期增殖潛力。事實(shí)上，早期結果表明，在早期時(shí)間點(diǎn)收獲的產(chǎn)物表現出更大比例的TCM細胞（CD45RO+CD62L+）和TN/TSCM細胞（CD45RO-/CCR7+），據報道，它們表現出治療上有利的表型和功能。

       使用加速生產(chǎn)的CAR-T細胞產(chǎn)品的一個(gè)例子是使用"T-Charge"平臺生產(chǎn)的CD19定向YTB323細胞，該平臺需要<2天的離體培養。據報道，與使用傳統CAR-T細胞生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的等效產(chǎn)品（tisa-cel）。值得注意的是，2期試驗的初步結果表明，YTB323在復發(fā)/難治性彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）患者中可以產(chǎn)生與tisa-cel相當的療效，但劑量低25倍，這表明減少的離體培養時(shí)間可能產(chǎn)生了功能優(yōu)越的產(chǎn)品。另一個(gè)例子是，在復發(fā)/難治性MM患者的1期試驗中，使用相同的T-Charge平臺生產(chǎn)的BCMA定向PHE885細胞實(shí)現了98%的總體緩解率。值得注意的是，93%（13/14）的患者在輸注后6個(gè)月可檢測到CAR-T細胞，在71%（5/7）的患者在12個(gè)月時(shí)可檢測到CAR-T細胞，表明體內T細胞具有強大的持久性。

       另一個(gè)名為FasTCAR-T的加速生產(chǎn)平臺已被用于為B-ALL患者生成"CD19F-CAR-T"細胞，其中92%（23/25）的患者實(shí)現了最小殘留病陰性完全緩解。該試驗中的大多數（20/25）患者繼續接受同種異體造血干細胞移植，因此無(wú)法評估對CAR-T細胞治療反應的長(cháng)期持久性。隨著(zhù)來(lái)自多項試驗的臨床數據不斷成熟，通過(guò)不同生產(chǎn)平臺產(chǎn)生的CAR-T細胞產(chǎn)品誘導的反應的相對持久性將是一個(gè)重要的關(guān)注點(diǎn)。

       與加速細胞生產(chǎn)過(guò)程相關(guān)的理論問(wèn)題是，在離體激活后不久冷凍保存的CAR-T細胞可能表現出過(guò)度刺激的表型。此外，特別是在血液系統惡性腫瘤的情況下，來(lái)自高度簡(jiǎn)化的生產(chǎn)工藝的產(chǎn)品增加了包含腫瘤細胞的可能性，否則這些細胞在針對T細胞生長(cháng)優(yōu)化的條件下，在延長(cháng)的離體培養期間會(huì )被耗盡。然而，現有的臨床數據表明，通過(guò)這些縮短方案生產(chǎn)的CAR-T細胞產(chǎn)品的安全性在臨床上仍然是可控的。YTB323治療DLBCL的1期研究結果顯示，33%（15/45）的患者經(jīng)歷過(guò)CRS，伴有1例4級事件，11%（5/45）出現免疫效應細胞相關(guān)神經(jīng)毒性綜合征（ICANS），伴有2例3級事件。在B-ALL患者中，CD19F-CAR-T細胞表現出更大的毒性，CRS的發(fā)生率增加了兩倍（總體為96%，≥級為24%），ICANS的發(fā)生率增加了一倍（28%，均為≥3級）。25名患者中有21名在CRS發(fā)作期間需要介入性皮質(zhì)類(lèi)固醇，盡管治療并未消融CAR-T細胞擴增峰值。來(lái)自正在進(jìn)行的臨床試驗的額外數據將有助于建立我們對通過(guò)不同平臺生產(chǎn)的CAR-T細胞產(chǎn)品之間生物學(xué)差異的理解。最后，需要注意的是，關(guān)于產(chǎn)品放行測試的監管要求仍然適用于采用加速工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品，并且在估計靜脈到靜脈的時(shí)間時(shí)，仍需要考慮此類(lèi)放行測試所需的時(shí)間。

       9.2流程自動(dòng)化

       改進(jìn)商業(yè)CAR-T細胞生產(chǎn)的另一種途徑涉及生產(chǎn)過(guò)程的自動(dòng)化，這有可能降低生產(chǎn)成本、人為錯誤導致生產(chǎn)失敗的可能性以及接觸點(diǎn)的污染。在某些司法管轄區（例如美國），一些自動(dòng)化系統被視為全封閉系統，允許在符合良好生產(chǎn)規范標準的設施外部運行。此外，自動(dòng)化可以顯著(zhù)減少生產(chǎn)人員所需的數量和經(jīng)驗水平。反過(guò)來(lái)，這些因素支持了現場(chǎng)生產(chǎn)的可能性，從而為患者提供新鮮、非冷凍保存的產(chǎn)品。在一項針對非霍奇金淋巴瘤患者的1期試驗中，患者接受了CD19/CD20雙特異性CAR-T細胞，這些細胞要么新鮮給藥，要么從凍存的等分試樣中解凍，早期數據顯示新鮮CAR-T細胞產(chǎn)品具有更高的活力（93%新鮮對63%凍存）。該試驗的后續報告證實(shí)，與使用冷凍保存的CAR-T細胞治療的患者相比，接受新鮮CAR-T細胞產(chǎn)品治療的患者的完全緩解率要高得多（80%新鮮對29%冷凍保存）以及更大的CAR-T細胞擴增和持久性。盡管細胞冷凍保存程序的改進(jìn)仍有可能減少新鮮和冷凍保存的CAR-T細胞產(chǎn)品之間觀(guān)察到的功效差異，但這些結果突出了現場(chǎng)細胞生產(chǎn)的潛在優(yōu)勢。然而，在確保產(chǎn)品質(zhì)量始終如一的同時(shí)，將這種做法擴展到大量醫療中心仍然是一個(gè)關(guān)鍵挑戰。重要的是，需要進(jìn)行幾項監管改革才能允許即時(shí)CAR-T細胞生產(chǎn)，而全球司法管轄區之間的差異代表了現場(chǎng)細胞生產(chǎn)實(shí)際實(shí)施的重大障礙。此外，使用新鮮細胞產(chǎn)品會(huì )妨礙完成需要較長(cháng)潛伏期的放行測試，因此需要依賴(lài)過(guò)程中的樣本測試以及應急臨床管理計劃，以應對在細胞產(chǎn)品輸注后收到無(wú)菌或其他測試結果失敗的情況。此外，新鮮產(chǎn)品的管理帶來(lái)了重大的物流挑戰，因為它需要細胞生產(chǎn)和患者接受細胞輸注的準備之間密切的時(shí)間協(xié)調。最后，當需要根據患者調整最佳過(guò)程參數設置時(shí)，自動(dòng)化系統的高度標準化性質(zhì)可能會(huì )帶來(lái)挑戰。例如，來(lái)自不同患者的細胞可能具有截然不同的擴增速率，因此每天在培養物中維持適當細胞密度所需的培養基量可能因生產(chǎn)活動(dòng)而異。為了實(shí)現最佳結果，需要配備儀器來(lái)感應關(guān)鍵參數并做出相應的響應。

       9.3體內細胞生產(chǎn)

       展望未來(lái)，下一代生產(chǎn)工藝可能會(huì )完全消除離體細胞作和擴增，而是在體內產(chǎn)生治療性細胞群。幾項臨床前研究表明，能夠使用慢病毒或腺相關(guān)病毒在體內轉導T細胞。此外，脂質(zhì)納米顆粒（LNP）和聚合物納米載體已被證明可以在體內將核酸有效載荷遞送到T細胞。為了實(shí)現T細胞靶向，病毒顆粒、LNP和納米載體通常用單鏈可變片段或其他靶向CD3、CD4或CD8的結合結構域修飾。然而，T細胞靶向的特異性可能不需要是絕 對的，人們可以考慮同時(shí)生成CAR-T細胞、CAR-自然殺傷細胞和CAR-巨噬細胞的潛在優(yōu)勢。然而，不將轉基因遞送到惡性細胞中仍然至關(guān)重要，因為這樣的整合事件可能導致CAR蛋白掩蓋靶抗原并保護腫瘤細胞免受表達CAR的效應細胞的檢測。此外，在可以實(shí)現穩定轉基因整合的病毒載體的情況下，脫靶基因遞送增加了遺傳毒性風(fēng)險。在實(shí)踐中，專(zhuān)門(mén)針對T細胞的轉基因遞送載體和促進(jìn)高效轉基因整合的策略，而無(wú)需外部T細胞激活，對于產(chǎn)生能夠實(shí)現持久抗腫瘤療效的有效劑量的CAR-T細胞可能是必要的。最后，在體內CAR-T細胞生產(chǎn)平臺的臨床轉化之前，需要進(jìn)行深入的藥代動(dòng)力學(xué)和安全性驗證。盡管仍然存在許多障礙，但繞過(guò)離體細胞生產(chǎn)的能力有可能顯著(zhù)降低成本，并增加需要這種治療選擇的患者獲得CAR-T細胞療法的機會(huì )。

       【NO.10】總結

       CAR-T細胞療法已成為血液系統惡性腫瘤越來(lái)越重要的治療選擇，臨床試驗不斷將CAR-T細胞療法的應用擴展到實(shí)體瘤和自身免疫性疾病的治療。因此，能夠高效可靠地生產(chǎn)高質(zhì)量細胞產(chǎn)品的CAR-T細胞生產(chǎn)工藝對于支持及時(shí)、安全和有效的患者護理至關(guān)重要。積累的臨床經(jīng)驗、真實(shí)世界的生產(chǎn)數據收集、自動(dòng)化系統工程的進(jìn)步以及對T細胞生物學(xué)的基本理解都在自體CAR-T細胞生產(chǎn)工藝的持續改進(jìn)中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用。此外，同種異體細胞療法的快速發(fā)展前景涉及額外的免疫效應細胞類(lèi)型以及干細胞群產(chǎn)生的T細胞，在未來(lái)幾年將繼續成為有趣的科學(xué)問(wèn)題和實(shí)際工程挑戰的來(lái)源。