2017年8月，諾華的CAR-T藥物Kymriah獲FDA批準，用于治療復發(fā)/難治性B細胞急性淋巴細胞白血病，完全緩解率達83%，首次實(shí)現"活細胞藥物"商業(yè)化。

       截至目前，全球獲批的細胞療法一共有42種，其中免疫細胞療法15種，干細胞療法27種。

       盡管細胞療法，特別是CAR-T，無(wú)論在臨床還是商業(yè)化上都取得了相當的成功，但由于高昂的價(jià)格、復雜的生產(chǎn)工藝、使用的不便宜性，限制了其在更大范圍的應用。

       當自體CAR-T在血液瘤治療上取得重大突破后，業(yè)內立即將目光投向了異體通用型CAR-T。但患者對于異體CAR-T的免疫排斥（HvG）始終是困擾業(yè)界的一大難題。至今，除了邦耀通過(guò)多基因編輯產(chǎn)生的通用型CAR-T（TyU19）在自免疾病患者治療上取得一定突破外，其它公司尚未在臨床上取得實(shí)質(zhì)性突破。

       近幾年，通過(guò)將CAR-T基因直接遞送到患者體內并表達在T細胞表面的In vivo CAR-T技術(shù)正悄然興起，而這些技術(shù)的領(lǐng)導者主要是歐美的初創(chuàng )型Biotech（表1），其中已有多家被MNC看中，或合作或被收購。國內方面，博生吉、沙礫、易慕峰、云頂新耀等企業(yè)也已做了深入布局。

       表1. 不同In vivo CAR-T公司列表

       從技術(shù)上來(lái)看，目前的In vivo CAR-T按遞送方式可以分為病毒及納米顆粒兩大類(lèi)（表1）。

       其中病毒遞送又以慢病毒為主，已有多款I(lǐng)n vivo CAR-T進(jìn)入臨床試驗。近日，EsoBiotec公布了其ESO-T01（圖1）的臨床1期試驗早期數據。

       圖1. ESO-T01結構示意圖

       首批4位患者在療效方面，1例患者在輸注后第28天骨髓中的腫瘤病灶和惡性血細胞完全消失，另1例患者在治療后兩個(gè)月達到相同效果。其余2例患者獲得部分緩解，表現為病灶縮小和癌細胞減少。安全性數據顯示，4例患者接受單次ESO-T01輸注后均出現不同程度不良反應：所有患者在輸注當日均出現寒戰、發(fā)熱等急性炎癥反應，其中3例出現需藥物干預的低血壓癥狀。

       慢病毒遞送CAR-T的優(yōu)勢在于：1）將CAR基因整合至宿主T細胞基因組中，保障CAR蛋白長(cháng)期穩定表達，使CAR-T細胞能夠持續發(fā)揮抗腫瘤作用，達到傳統CAR-T的效果。2）相比γ-逆轉錄病毒只能感染分裂細胞，慢病毒可有效感染處于靜止期的T細胞，適用于T細胞早期狀態(tài)，能夠對更多的T細胞進(jìn)行改造，提高治療效果。3）能攜帶約8kb外源序列，適合構建多靶點(diǎn)、裝甲化CAR結構，為CAR-T細胞的設計和功能多樣化提供了更多的可能性。

       但其缺點(diǎn)也比較明顯：1）慢病毒本身具有一定的免疫原性，可能會(huì )引發(fā)機體的免疫反應。一方面，患者體內可能預先存在針對慢病毒的中和抗體，這會(huì )降低病毒載體的感染效率，影響CAR-T細胞的生成；另一方面，免疫反應可能會(huì )導致炎癥等不良反應，影響治療的安全性和有效性。2）慢病毒的隨機整合可能會(huì )導致插入突變，干擾宿主基因組的穩定性，增加繼發(fā)性腫瘤發(fā)生的幾率。3）慢病毒載體的生產(chǎn)需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)和設備，生產(chǎn)過(guò)程較為復雜，包括病毒顆粒的包裝、純化等環(huán)節，對生產(chǎn)環(huán)境和質(zhì)量控制要求很高，這使得慢病毒體內CAR-T療法的生產(chǎn)成本較高。

       而使用納米顆粒，特別是脂質(zhì)納米顆粒（LNP），作為遞送載體的技術(shù)方式相較于慢病毒具有一定優(yōu)勢：1）LNP遞送的mRNA不整合基因組，僅短暫表達（數天至1周），可避免長(cháng)期毒性，如插入突變、持續免疫激活等。此外，可多次給藥調節療效，能減少細胞因子風(fēng)暴的風(fēng)險。2）LNP作為已經(jīng)獲得FDA批準的遞送系統，可標準化生產(chǎn)，不依賴(lài)于細胞體系，便于放大。3）LNP的脂類(lèi)化合物具有良好的生物相容性，其表面的PEG修飾脂質(zhì)可阻礙單核巨噬細胞的攝取和血清蛋白的黏附，減少免疫原性，有助于減少非特異性免疫反應，從而促進(jìn)更精準的抗原特異性免疫應答。4）LNP的降解產(chǎn)物為無(wú)毒的小分子物質(zhì)，能夠通過(guò)代謝途徑排出體外，確保了其在體內的安全性。

       因此，我們可以把利用LNP作為載體通過(guò)靶向免疫細胞遞送CAR-T mRNA的藥物（tLNP）看作是一種大分子藥物，甚至是一種ADC藥物，而這類(lèi)ADC的Payload就是包含mRNA的LNP。

       目前tLNP比較有代表性的產(chǎn)品有Capstan的CPTX2309及NanoCell的NCtx-CD19（圖2）。

       圖2. （A）CPTX2309；（B）NCtx-CD19結構示意圖

       tLNP作為一種ADC，可以拆解為三個(gè)主要元件：1）抗體；2）LNP；3）mRNA。而這三個(gè)元件的設計、優(yōu)化及組合將決定產(chǎn)品能否取得臨床及商業(yè)化成功。

       1、抗體

       如果靶向T細胞，可供選擇的抗體靶點(diǎn)包括CD3、CD5、CD7、CD8、TCR等。而這些靶點(diǎn)如何組合？抗體如何選擇親和力及Epitope?抗體選擇什么樣的Format（IgG、VHH、scFv、Fab等）？這些設計將決定tLNP的靶向特異性及T細胞激活的強度及持久性，也在一定程度決定了藥物的療效及安全性。

       2、LNP

       傳統LNP最大的局限是易于在肝臟聚集，主要原因是LNP的脂質(zhì)組成及表面電荷使其吸附血液中的脂蛋白與肝臟中的脂蛋白受體結合而聚集。

       LNP由四種成分組成：1）陽(yáng)離子脂質(zhì)；2）磷脂；3）膽固醇；4）PEG-脂質(zhì)（圖3）。

       圖3. LNP結構示意圖

       其中，陽(yáng)離子脂質(zhì)是LNP遞送系統中最關(guān)鍵的組分，決定了遞送效率和轉染效率。膽固醇在LNP中起到穩定納米顆粒結構、促進(jìn)mRNA胞內攝入和胞質(zhì)進(jìn)入的作用。磷脂有助于mRNA的封裝、穩定脂質(zhì)雙層結構、提高mRNA遞送效率。PEG-脂質(zhì)可以提高納米顆粒的整體穩定性，延長(cháng)納米顆粒在血液中的代謝時(shí)間。

       通過(guò)調整脂質(zhì)化學(xué)結構、成分及劑型來(lái)優(yōu)化LNP，降低其肝臟靶向性并對富含T細胞的脾臟（或其它免疫組織）具有更好的靶向性，同時(shí)增強血液穩定性，是tLNP的主要研究目標。

       Capstan的創(chuàng )始人之一，美國賓大的Michael J. Mitchell教授團隊，通過(guò)合成252種含硅氧烷的類(lèi)脂質(zhì)，發(fā)現負電荷脂質(zhì)能增強脾臟遞送。從Capstan已公開(kāi)的專(zhuān)利來(lái)看，CICL-1（US20230320095A）和CICL-207（US2025127728A1）兩款陽(yáng)離子脂質(zhì)對脾臟有較好的靶向性（圖4）。

       圖4. CICL-1及CICL-207結構示意圖

       此外，在Capstan專(zhuān)利（WO2023196445及WO2024249954）中分別對PEG-脂質(zhì)進(jìn)行改造修飾以提高轉染效率及連接CD47多肽，從而降低巨噬細胞的識別以提高生物利用度。

       另外，LNP的粒徑影響其內化、生物分布、免疫原性、降解和清除，通常LNP的最佳粒徑范圍為20-200nm。通過(guò)優(yōu)化LNP各組分的比例和種類(lèi)，可提高LNP的穩定性和對mRNA的保護作用。

       因此，對于LNP脂化學(xué)結構及制劑的不斷優(yōu)化改造將是未來(lái)tLNP主要研發(fā)方向之一，也將是各家公司不同產(chǎn)品的主要差異化點(diǎn)。

       3、mRNA

       作為遞送入細胞進(jìn)行轉染的mRNA，面臨穩定性、免疫原性及轉染效率等諸多挑戰。

       多年研究發(fā)現，可以通過(guò)用人工合成的非天然核糖核酸替換天然核糖核酸來(lái)合成mRNA，如使用假尿嘧啶核苷（Ψ）替代尿嘧啶核苷，可減少模式識別受體（PRRs）的激活，降低免疫反應，增強mRNA的翻譯效率和穩定性。

       用常見(jiàn)密碼子替換稀有密碼子可以增加mRNA翻譯水平，提高mRNA的穩定性和翻譯效率。增加GC含量也可以提高mRNA翻譯水平并降低免疫原性。

       5'帽結構是mRNA翻譯和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的重要識別位點(diǎn)，其完整性對mRNA的穩定性至關(guān)重要。3'多聚A尾的縮短會(huì )導致mRNA降解速率加快，因此要保證3'多聚A尾的完整性和適當長(cháng)度。

       在5′UTR之后引入Kozak共識序列可提高穩定性和翻譯起始水平。選擇人α珠蛋白和β珠蛋白3′UTR序列可顯著(zhù)提高mRNA的穩定性和翻譯效率。在編碼序列和多聚A尾部之間以頭尾方式引入兩個(gè)β珠蛋白的3′UTR序列，能進(jìn)一步提高mRNA的穩定性和翻譯效率。

       而NanoCell等公司選用的環(huán)狀RNA既無(wú)5'帽結構也無(wú)3'多聚A尾，在穩定性、免疫原性、生產(chǎn)成本等方面相較于傳統線(xiàn)性mRNA具有一定優(yōu)勢，但在環(huán)化效率、純化、表達調控等方面仍具挑戰（圖5）。

       圖5. 線(xiàn)性及環(huán)狀mRNA對比

       隨著(zhù)tLNP CAR-T陸續進(jìn)入臨床，這種In vivo CAR-T技術(shù)將面臨有效性、安全性及持久性的考驗。如何優(yōu)化T細胞靶向特異性？如何找到合適的轉染效率？如何降低免疫原性？如何確定合適的給藥劑量及給藥周期以實(shí)現長(cháng)期藥效？與傳統CAR-T相比，In vivo CAR-T的胞內共刺激信號是否需要進(jìn)一步優(yōu)化？等等，這些問(wèn)題將是tLNP產(chǎn)品不斷優(yōu)化并在臨床上取得驗證的重要方向。

       tLNP作為一種顛覆性技術(shù)，一旦在臨床上取得突破，將意味著(zhù)細胞治療進(jìn)入大分子藥物時(shí)代。