雙特異性抗體（bsAbs）簡(jiǎn)直是生物界的 "雙面間諜"，憑借一手 "左右開(kāi)弓" 的結合絕技圈粉無(wú)數。它能同時(shí)盯上兩個(gè)抗原靶點(diǎn)，搞出 1+1>2 的協(xié)同效果，連傳統單特異性抗體組隊都得甘拜下風(fēng)。不過(guò)這位 "潛力股" 的成長(cháng)之路可不順，設計構建時(shí)總被各種麻煩絆住腳 -- 誰(shuí)讓它的結構復雜度比傳統抗體高出好幾個(gè)段位呢。這些麻煩五花八門(mén)：外源抗原結合域一融合，生物物理穩定性就掉鏈子；抗體鏈還總愛(ài) "錯點(diǎn)鴛鴦譜"，結果生出些難以清除的 "雜質(zhì)寶寶"。想讓 bsAbs 既有預期的 "超能力"，又具備優(yōu)秀的 "藥界潛質(zhì)"，就得在設計時(shí)精打細算，再給它來(lái)一輪全方位的分子工程 "改造升級"。本文就來(lái)好好嘮嘮 bsAbs 設計里的那些關(guān)鍵考量，以及能高效打造不同分子形態(tài) bsAbs 的先進(jìn)工程原理。

       簡(jiǎn)介

       近年來(lái)，雙特異性抗體（bsAbs）在治療界可謂 "C 位出道"，為靶向治療打開(kāi)了一扇新大門(mén)。它有個(gè)獨門(mén)絕技 -- 能同時(shí)對兩個(gè)不同靶點(diǎn) "下手"，從而協(xié)同靶向疾病通路，這可是傳統免疫球蛋白組合想都不敢想的操作。雖說(shuō)治療性 bsAbs 是人工工程的 "杰作"，但在自然界也能偶爾撞見(jiàn)它們的身影，比如通過(guò) IgG4 半分子的 Fab 臂交換形成的那種。

       工程 bsAbs 的結合 "十八般武藝"，讓人們對它在多種疾病中的應用浮想聯(lián)翩，癌癥、自身免疫性疾病、傳染病都可能被它攻克。最近有篇文章更是把雙特異性和多特異性藥物封為 "療法新勢力"。bsAb 的治療潛力讓這個(gè)領(lǐng)域成了 "香餑餑"，競爭那叫一個(gè)白熱化，但也催生出不少腦洞大開(kāi)的工程奇跡，看看臨床階段 bsAb 五花八門(mén)的分子形態(tài)就知道了。

       作用機制

       bsAbs 的雙重結合能力，讓它的作用機制（MOA）比傳統單克隆抗體復雜得多，簡(jiǎn)直像個(gè)精密的 "生物鐘表"。對很多 bsAbs 來(lái)說(shuō)，想要發(fā)揮作用，兩個(gè)結合事件得在特定時(shí)間和空間 "約會(huì )"。也就是說(shuō)，兩種結合特異性不僅得按特定物理排列 "站位"（比如把兩個(gè)靶標拉得近近的，誘導下游信號傳導），還得講究 "時(shí)機"（比如同時(shí)連接細胞，或者按順序靶向跨越屏障）。

       有些 bsAbs 的作用機制，光靠?jì)蓚€(gè)親本抗體 "組隊" 根本搞不定，這種就被稱(chēng)為 "專(zhuān)性 bsAbs"。但就算沒(méi)有這種 "非它不可" 的機制，bsAbs 往往也不只是簡(jiǎn)單的 "零件拼接"，效力常常比親本抗體組合強得多。據推測，這可能是沾了親和力的 "光"。

       雙重靶向還能提高靶標選擇性和定位精度，從而減少副作用，對于避免 "誤傷友軍"（也就是 "在靶、脫瘤" 效應）特別有用。就算 bsAb 的活性和親本抗體組合差不多，它在生產(chǎn)上也有優(yōu)勢 -- 畢竟只需要生產(chǎn)一個(gè)分子，省事兒多了。

       BsAb 的雙靶向活性大致能分為 "順式" 和 "反式" 兩類(lèi)。能不能把特定抗原結合域巧妙 "混搭"，針對性地作用于相同（順式）或不同（反式）的細胞 / 分子靶點(diǎn)，直接決定了 BsAb 能不能發(fā)揮協(xié)同功能。

       反式作用的 BsAbs 就像 "紅娘"，專(zhuān)找不同的靶點(diǎn) "牽線(xiàn)搭橋"，形成物理連接。要是它結合的是不同細胞靶點(diǎn)，那作用機制就全靠把兩種細胞 "綁" 在一起，實(shí)現細胞間 "搭橋"。雙特異性 T 細胞銜接子就是個(gè)典型例子，它一邊勾搭腫瘤相關(guān)抗原，一邊聯(lián)系 CD3（一種超強共刺激受體），成功讓 T 細胞和腫瘤細胞 "見(jiàn)面"（圖 1A）。這貨還能繞過(guò) T 細胞的自然活化流程，通過(guò)聚集低親和力 T 細胞受體，直接把 T 細胞 "騙" 到表達腫瘤相關(guān)抗原的細胞那兒去。

       "非反式" 這個(gè)詞在分子層面也有用武之地，比如雙互補位抗 HER2 bsAb，它結合的是兩個(gè)不同的 HER2 分子（非反式），而不是同一個(gè)（順式）。這種交叉結合能把相鄰分子連起來(lái)，誘導 HER2 發(fā)生不一樣的重組，還能引發(fā)補體依賴(lài)性細胞毒性，這可是單特異性抗 HER2 抗體組合做不到的。這種分子非反式結合，主要和那些靶向同一抗原上不同且不重疊表位的雙互補位 bsAb 有關(guān)。

       順式作用的 bsAb 則像 "同小區保安"，主要盯著(zhù)同一細胞上的抗原（圖 1B、C）。能激活同一細胞表面兩個(gè)受體的激動(dòng)劑 bsAb（細胞順式激活），可以通過(guò)精確控制受體亞基 "牽手" 來(lái)選擇性調控信號傳導。比如有個(gè)靶向白介素（IL）-2 受體亞基 IL-2Rβ 和 IL-2Rγ 的 bsAb，它能通過(guò)中等親和力的 IL-2Rβγ 增強信號傳導，同時(shí)削弱高親和力 IL-2Rαβγ 的信號。還有個(gè)靶向死亡受體（DR）4 和 5 的雙重激動(dòng)劑雙特異性 Surrobody，效力比親本抗體組合強，可能是因為它能讓 DR4 和 DR5 "抱團" 形成異二聚體。

       另一種順式激活 bsAbs 被稱(chēng)為 "輔因子模擬器"，主要作用是幫酶和它的 "專(zhuān)屬底物" 找準位置（圖 1F）。凝血因子 FVIIIa 模擬物就是這么個(gè)角色，能促進(jìn) FIXa 和 FX "相遇"。這倆一旦 "組隊"，就會(huì )生成活化因子 Xa（FXa），這可是凝血途徑的關(guān)鍵 "推手"，所以這類(lèi) bsAb 和血友病 A 的治療關(guān)系密切。對于那些產(chǎn)生了抗 FVIII 同種抗體的患者來(lái)說(shuō)，重組 FVIII 治療基本沒(méi)用，這種 bsAb 輔因子模擬物可就成了 "救星"。

       圖 1. bsAb的特異性作用機制。(A)反式細胞橋接通過(guò) bsAb 在不同細胞之間建立了物理連接。該機制尤其適用于 T 細胞重定向 bsAb，因為這種物理連接有助于靶向激活 T 細胞的細胞毒性。(B)受體的順式橋接引起激動(dòng)劑交聯(lián)，并激活相關(guān)的受體信號傳導。(C)順式拮抗作用阻斷受體結合，從而阻止信號通過(guò)受體復合物進(jìn)行傳導。(D)搭載型 bsAb 利用一種特異性靶向受體，該受體有助于跨膜轉位到原本無(wú)法進(jìn)入的區室，而另一種特異性則在此發(fā)揮其功能。閃電表示由抗體結合介導的活性。(E) BsAb可以發(fā)揮定位效應。例如，激動(dòng)劑 bsAb也具有腫瘤靶向特異性，通過(guò)將激動(dòng)劑機制限制在腫瘤標志物存在的位點(diǎn)，限制了靶向、非腫瘤效應。(F) BsAbs通過(guò)準確定位酶和底物充當輔助因子模擬物。

       也可以用拮抗性 bsAb 來(lái) "搗亂" 信號通路，它們會(huì )霸占細胞受體，不讓可溶性受體配體 "靠近"。這類(lèi)拮抗性 bsAb 常被用來(lái)阻斷免疫檢查點(diǎn)受體，這可是抗癌免疫治療里的 "明星靶點(diǎn)"。比如雙重阻斷免疫檢查點(diǎn)通路，或者同時(shí)盯上免疫檢查點(diǎn)和抗腫瘤免疫的負調節因子（像與不良預后相關(guān)的 TGF-β）。

       順式作用的拮抗性 bsAb 還能靶向相關(guān)或重疊的信號通路。所以這類(lèi) bsAb 可以一邊對付原發(fā)性癌癥相關(guān)通路，一邊處理那些可能因為原發(fā)通路被阻斷而 "冒頭" 的相關(guān)通路，從而阻止癌細胞 "逃之夭夭"。HER2xHER3 雙特異性抗體就是個(gè)例子，HER3 的上調可是 HER2 抑制劑耐藥的 "罪魁禍首"。

       激動(dòng)劑型 BsAbs 的發(fā)現可比拮抗性的難多了，畢竟抗體的激動(dòng)活性受一堆難以捉摸的因素影響。比如有研究發(fā)現，激動(dòng)劑型抗 CD3 BsAbs 的細胞毒活性就和親和力、表位、分子幾何形狀脫不了干系。相比之下，有效的拮抗劑通常只要親和力高，能和天然配體 "搶位置" 阻斷其作用就行。另外，把 BsAbs 組合起來(lái)還能獲得治療效應機制的額外協(xié)同效果，不過(guò)這可能會(huì )讓作用機制更復雜，給 BsAb 設計再添點(diǎn) "麻煩"。

       Fc 的作用

       所有天然抗體都帶著(zhù)個(gè) "功能小助手"--Fc 區，它對抗體的效應功能至關(guān)重要，通過(guò)和同源 Fc 受體以及補體蛋白等可溶性免疫介質(zhì)結合，觸發(fā)宿主細胞反應。對 Fc 蛋白和糖進(jìn)行 "改造"，能消除或大幅增強 Fc 介導的效應功能，比如 NK 細胞的抗體依賴(lài)性細胞毒作用（ADCC）、巨噬細胞的抗體依賴(lài)性細胞吞噬作用（ADCP），甚至某些 CD8 T 細胞反應。

       人們在設計傳統單特異性抗體的 Fc 區上花了不少功夫，就是為了讓它具備天然同種型沒(méi)有的效應功能（或者去掉某些功能）。比如給 IgG1 抗體加個(gè) FcγR 沉默突變，就能造出效應子減少的版本，但還保留著(zhù) IgG1 的優(yōu)良特性。反過(guò)來(lái)，搞搞糖工程，比如給 Fc-IgG1 N - 糖去掉核心巖藻糖，或者做點(diǎn)突變，能增強和某些 Fc受體的結合，從而提升效應功能，像 FcγRIIIa 介導的 ADCC 或 ADCP。這些效應調節突變或糖工程，通常和 bsAb 常見(jiàn)的突變（比如用于鏈轉向的突變）不沖突，所以在含 Fc 的 bsAb 里也能組合使用。

       根據預期的藥理作用（MOA），有些 BsAb 可能更適合 "改造" Fc 區，有些則完全不用動(dòng)。臨床開(kāi)發(fā)的 BsAb 大多都帶著(zhù) Fc 區，畢竟這個(gè)結構域能用 Protein A輕松純化，而且 FcRn 循環(huán)還能延長(cháng)半衰期。含 Fc 區的 BsAb 根據分子幾何結構，大概能分成對稱(chēng)型和非對稱(chēng)型。

       雖說(shuō) Fc 區改造技術(shù)挺成熟，但有時(shí)候，基于小片段的 bsAb 比大型 IgG 樣 bsAb 更有優(yōu)勢?；谄蔚?bsAb 通常是把獨立抗原結合結構域通過(guò)基因融合 "拼" 出來(lái)的，也能用多聚化結構域組裝。這種方法的好處是，產(chǎn)物通常個(gè)頭小，還沒(méi)有重要的糖基化位點(diǎn)，用細菌或酵母這類(lèi)簡(jiǎn)單表達系統就能高產(chǎn)。

       基于片段的 BsAb 通常就一兩條多肽鏈，大大降低了因鏈錯配產(chǎn)生 "雜質(zhì)寶寶" 的風(fēng)險，這可是那些個(gè)頭大、結構復雜的 BsAb 常遇到的頭疼事。而且，抗原結合結構域通過(guò)簡(jiǎn)單基因融合，在價(jià)態(tài)和特異性組合上特別靈活，比如能搞出 1+3 和 3+3 的 BsAb 形式。

       傳統上，不含 Fc 區的基于片段的 bsAbs 多是用 scFv 片段做的，把它們以不同方式組合，能形成 BiTE、TandAb 或 DART 分子，這些都是 scFv 基片段 bsAbs 的主要類(lèi)型（圖 2A）。不過(guò) scFv 片段常有點(diǎn) "小脾氣"，熱力學(xué)不穩定，還愛(ài)搞 VH-VL 錯配，結果生成不想要的自組裝產(chǎn)物。

       scFv 的這些 "毛病" 讓人們把目光投向了單域抗體（sdAbs）。sdAbs 也是小個(gè)子（約 15 kDa）的抗原結合域，能通過(guò)基因融合形成基于片段的 bsAbs，而且它穩定又結實(shí)，本質(zhì)上是單體，不容易發(fā)生不良自組裝。把 sdAbs 分別融合到 CH1 和 Cκ 上，不用接頭也能組合，借助恒定結構域的自然配對作為二聚化基序，就能生成小的 Fab 樣 bsAbs。當然啦，抗原結合結構域的組合方式還有很多，遠不止上面說(shuō)的這些。

       基于片段的 bsAb 有個(gè)潛在 "短板"-- 個(gè)頭小又沒(méi)有 FcRn 結合區，所以清除得快。不過(guò)在某些應用和形式中，這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)得到解決，比如把 bsAb 和 HSA 偶聯(lián)，或者加個(gè)抗 HSA 抗體片段。

       圖 2 .根據分子結構分類(lèi)的最常見(jiàn) bsAb形式的示意圖。（A）基于片段的 bsAb 是由不帶 Fc 結構域的小抗原結合片段組合而成。其構建單元通常是 scFv 片段或 sdAb。（B）對稱(chēng) Fc 結構 bsAb 由一到兩條多肽鏈表達，通常通過(guò)將額外的抗原結合片段融合到 IgG 骨架上來(lái)實(shí)現。（C）不對稱(chēng) Fc 結構 bsAb 由兩到四條多肽鏈組裝而成。不對稱(chēng) bsAb 需要采取措施避免鏈錯配。示意圖中的小"旋鈕"和"孔"用于一般性地表示需要使用鏈轉向技術(shù)來(lái)確保 HC:HC 異二聚化和/或正確的 HC:LC 配對的位置。

       對稱(chēng)雙特異性抗體

       對稱(chēng)型 bsAb 堪稱(chēng)抗體界的 "標準款"，外形酷似 IgG，嚴格遵循 HC2LC2 的結構套路。但別以為它就此墨守成規 -- 它偷偷融合了額外的外源結合域，搖身一變成為能同時(shí)瞄準兩個(gè)抗原的 "雙料選手"。

       正因如此，這些 bsAb 大多是四價(jià)的 2+2 型雙特異性抗體（每種抗原各打兩槍?zhuān)?，但若想升級火力，通過(guò)雙融合還能改造成六價(jià)的 2+4 型 bsAb。要說(shuō)最常見(jiàn)的四價(jià) 2+2 型，那可就有不少成員了：scFv-IgG 融合體、DVD-Ig、串聯(lián) scFv-Fc、sdAb-IgG 融合體，還有 tetra-VH IgG（見(jiàn)圖 2），個(gè)個(gè)都是武林高手。

       對稱(chēng)型 bsAbs 的一大 "懶人福利" 就是組裝起來(lái)特別省心，只需表達一兩條不同的多肽鏈就行。這意味著(zhù)跟那些需要共表達三到四條多肽鏈的非對稱(chēng) bsAbs 比起來(lái)，它在初始篩選時(shí)，質(zhì)粒轉染比例的優(yōu)化工作簡(jiǎn)直是小巫見(jiàn)大巫。而且 HC2LC2 結構還大大降低了抗體鏈組裝出錯的概率，純化方案自然也就簡(jiǎn)單多了。反觀(guān)非對稱(chēng) bsAbs，常常得額外加幾道純化工序，才能清除那些因組裝失誤產(chǎn)生的 "不合格產(chǎn)品"。

       不過(guò)，凡事有利有弊，HC2LC2 結構也限制了價(jià)態(tài)的 "自由度"，因為抗原結合域總是成對出現。這就讓它在某些特殊場(chǎng)合束手束腳，比如遇到需要單價(jià)靶向以防止不良交聯(lián)的抗原（像 CD3 這種），就只能望洋興嘆了。

       在設計對稱(chēng)型 bsAbs 時(shí)，選對外源抗原結合域可是個(gè)技術(shù)活。以前大家偏愛(ài) scFv，畢竟它從常規抗體的 Fv 結構域衍生出來(lái)很方便。但現在，小個(gè)子 sdAb 正憑借獨特優(yōu)勢異軍突起，成為炙手可熱的融合搭檔。它天生嬌小，還是單體，不像 scFv 那樣總愛(ài)搞 "小團體"-- 也就是不良自組裝和聚集，實(shí)在是省心不少。

       通常會(huì )用 10-25 個(gè)氨基酸的甘氨酸 - 絲氨酸接頭來(lái)融合外源抗原結合結構域，這家伙在水溶液里柔韌性和穩定性都沒(méi)得說(shuō)，堪稱(chēng) "最佳粘合劑"。其他 bsAb 構建體則另辟蹊徑，選用源自天然抗體接頭區域的接頭，比如抗體鉸鏈區，或者連接 Fv 和 CH1/Cκ 的柔性接頭。選對合適的接頭，對保證抗原結合結構域的正確間距和展示效果至關(guān)重要。有研究發(fā)現，接頭長(cháng)度還會(huì )影響 DVD-Ig 分子的抗原結合能力和穩定性，真是差之毫厘，謬以千里。

       抗體的模塊化特性簡(jiǎn)直是設計師的福音，外源抗原結合結構域既可以融合在支架多肽鏈內部，也能接在末端，這樣就能打造出結構五花八門(mén)的 bsAbs，完全可以根據需求量身定制。雖然這些外源抗原結合片段通常會(huì )跟全長(cháng) IgG 分子結合，但它們也能直接與 Fc 結構域融合，讓構建體比全長(cháng) IgG 分子小巧玲瓏，同時(shí)還能保留 Fc 區的功能，可謂一舉兩得。

       除了把獨立的抗原結合結構域融合到 IgG 支架上，還有些別出心裁的策略用來(lái)開(kāi)發(fā)對稱(chēng)的 IgG 樣 bsAbs。比如四重 VH IgG，它通過(guò)把不同的結合特異性分配到 Fv 的每個(gè)可變域上（用獨立的 sdAb 替換 VH 和 VL）實(shí)現雙特異性。還有更絕的，把單個(gè) Fab 域的 6 個(gè)互補決定區（CDR）在空間上分成 VH 互補位（CDRH1、CDRL2 和 CDRH3）和 VL 互補位（CDRL1、CDRH2 和 CDRL3），再把這些單獨的互補位組合起來(lái)，就形成了稱(chēng)為 DutaFab 的單個(gè)雙特異性 Fab 域，真是把 "拆分重組" 玩得明明白白。

       非對稱(chēng)雙特異性抗體

       非對稱(chēng) BsAb 的分子幾何結構，讓它的設計和生產(chǎn)難度比對稱(chēng) BsAb 高出不少，這主要是因為不同抗體鏈共表達時(shí)，很容易產(chǎn)生抗體相關(guān)雜質(zhì)，就像一鍋粥里混進(jìn)了沙子，讓人頭疼。盡管有這些實(shí)際難題，非對稱(chēng) BsAb 依舊在進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)的 BsAb 類(lèi)型中占據主力位置，看來(lái)實(shí)力不容小覷。

       非對稱(chēng) BsAb 的一大顯著(zhù)優(yōu)勢是，它的分子幾何結構跟 IgG 的天然結構長(cháng)得很像，這就讓它能充分利用 IgG 良好的類(lèi)藥特性，相當于站在巨人的肩膀上。而且非對稱(chēng)結構讓價(jià)態(tài)擁有了高度靈活性，比如能形成單價(jià)特異性（1+1），這可是對稱(chēng) bsAbs 辦不到的 "獨門(mén)絕技"。另外，那些結構跟 IgG 分子相似度高的非對稱(chēng) bsAbs，被認為能降低免疫原性風(fēng)險，這可是個(gè)大大的加分項。不過(guò)要說(shuō)明的是，非對稱(chēng) bsAbs 也能形成偏離嚴格二價(jià) Y 形 IgG 幾何形狀的結構，比如三價(jià) 2+1bsAbs，真是個(gè)靈活的多面手。

       HC:HC 配對

       非對稱(chēng)雙特異性抗體（bsAb），最讓人頭疼的問(wèn)題就是多肽鏈錯配，結果就是產(chǎn)生一堆產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，簡(jiǎn)直是生產(chǎn)路上的 "攔路虎"。許多非對稱(chēng)雙特異性抗體都得靠?jì)煞N不同重鏈（HC）的異二聚化來(lái)發(fā)揮作用，所以大家對能促進(jìn) HC 異二聚化的 HC 轉向平臺格外關(guān)注，都盼著(zhù)能找到解決問(wèn)題的鑰匙。

       目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出不少 HC 轉向平臺，大多源自行業(yè)內部，它們的工作原理是在 CH3 域中創(chuàng )建互補界面，而 CH3 域可是控制抗體結構完整性的關(guān)鍵部位。不過(guò)，對結構如此重要的 CH3 結構域進(jìn)行突變，常常也會(huì )影響 bsAb 的熱穩定性，真是牽一發(fā)而動(dòng)全身。

       雖然這些 CH3 轉向平臺的詳細設計原理在其他地方已有透徹的研究，但值得注意的是，這些平臺都在努力引入結構互補的突變，目的是讓 HC 更傾向于異二聚化，同時(shí)抑制 HC 同二聚體的形成，就像在給 HC"牽紅線(xiàn)"，讓它們按指定對象結合。

       其中，第一個(gè)被報道且應用最廣泛的平臺是旋鈕入孔（KiH）。它的操作很有意思，在一個(gè) HC 里安插一個(gè)大個(gè)頭的色氨酸，在另一個(gè) HC 里配上空間互補的小個(gè)子殘基，就像鑰匙和鎖一樣嚴絲合縫。KiH 策略之所以被廣泛采用，一是因為它在抑制 HC 同型二聚體方面效果顯著(zhù)（除了極少量的孔 - 孔同型二聚體），二是因為它的專(zhuān)利已經(jīng)過(guò)期，不用再為專(zhuān)利費發(fā)愁。這樣一來(lái)，KiH 就為構建不對稱(chēng) bsAb 提供了一條相對輕松又免費的路，要知道在這個(gè)領(lǐng)域競爭激烈，還多由行業(yè)主導，其他好幾個(gè)平臺都受專(zhuān)利保護著(zhù)呢，想用上可不太容易。

       在構建用于異二聚化的 HC 時(shí)，得明白 HC 異二聚體的相對豐度其實(shí)是一種平衡狀態(tài)，并非固定不變。這種平衡會(huì )受到多種因素影響，比如相對質(zhì)粒和表達水平，通常得通過(guò)優(yōu)化質(zhì)粒轉染率來(lái)控制。這事兒可能相當費時(shí)間，尤其是在表達許多不同的 bsAb 時(shí)，簡(jiǎn)直是對耐心的極大考驗。

       比如我們最近就報道了一種不對稱(chēng) IgG/sdAb-Fc 構建體，調整 HC 質(zhì)粒轉染率后，兩條 HC 鏈的表達才達到最均衡的狀態(tài)，這說(shuō)明兩條 HC 可不會(huì )乖乖地平等共表達，還得靠人為調節。其他研究也發(fā)現，可變結構域的性質(zhì)會(huì )影響 HC 異二聚化，真是一環(huán)扣一環(huán)。

       CH1 結構域在 IgG 分子的組裝和運輸中扮演著(zhù)重要角色，這也解釋了為什么當 Fab 結構域被 sdAbs 或 scFvs 等片段取代后，HC 的表達行為會(huì )發(fā)生變化。有趣的是，有人通過(guò)對高表達的 λ 鏈進(jìn)行密碼子去優(yōu)化，來(lái)平衡表達量較低的 κ 鏈，居然還改進(jìn)了異二聚 κλ bsAb 的組裝，實(shí)際上提高了目標 bsAb 的產(chǎn)量，這波操作真是讓人眼前一亮。

       HC:LC 配對

       在雙特異性抗體（bsAb）的世界里，HC 和 LC 的配對就像一場(chǎng)嚴格的相親大會(huì )。選擇擁有共同 LC 的 bsAb，就好比給相親雙方定了個(gè)共同的擇偶標準，能從源頭上消除錯配的尷尬。不過(guò)，要找到這樣的 "共同語(yǔ)言" 可沒(méi)那么容易，不僅耗時(shí)，還得在序列多樣性上做出讓步，這無(wú)疑給尋找既專(zhuān)一又深情（高親和力）的結合物增加了不少難度。

       但話(huà)說(shuō)回來(lái)，共同 LC 這種方法也不是全無(wú)好處。它只需表達三條多肽鏈，在可制造性上算是松了口氣，就像原本要準備三桌飯菜，現在兩桌就夠了，確實(shí)省心不少。同理，找到有共同 HC 的 bsAb 也能避免 HC 錯配的問(wèn)題，算是另一種 "捷徑"。

       其他方法則像是給 Fab 裝上了 "導航系統"，通過(guò)合理設計讓它們別走錯路，防止在不同多肽鏈共表達時(shí)鬧 "烏龍"。比如 Crossmab、正交 Fab 界面、交換 CH1/CL 結構域、給天然鏈間二硫鍵做 "工程改造"，還有嫁接 IgE 衍生的異二聚化結構域，這些操作都像是給抗體配對上了多重保險。

       使用兩種不同的 HC 和 LC，能讓 VH 和 VL 結構域自由 "談戀愛(ài)"，在尋找靶向特異性 bsAb 時(shí)不受束縛，盡情展現多樣性?？闪硪环矫?，4 條多肽鏈要想平衡共表達，簡(jiǎn)直比讓四個(gè)性格迥異的人同時(shí)合拍地跳一支舞還難。這就需要在載體設計和生產(chǎn)克隆生成上多花心思，甚至還會(huì )給下游工藝帶來(lái)額外壓力，像是一場(chǎng)艱難的協(xié)調工作。

       當然，也可以先讓每個(gè)抗體半單獨表達，之后再組裝成最終的 bsAb 構建體，通過(guò)這種 "先分居后同居" 的方式得到正確的 HC:LC 配對。但這種策略就像在原本的生產(chǎn)流程中加了道 "中間商"，不僅要額外克隆生成和生產(chǎn)兩個(gè)組件，還得處理鉸鏈二硫鍵的充分還原和氧化等棘手步驟，簡(jiǎn)直是給自己找麻煩。

       還有些策略更絕，把其中一個(gè) Fab 臂換成單鏈 Fab（scFab）結構域，讓 bsAb 只由 3 條多肽鏈組成。scFab 的柔性接頭就像個(gè)靈活的 "月老"，能促進(jìn) VH/CH1和 VL/CL 的正確配對。有意思的是，有些 Fab 域像是專(zhuān)一的 "癡情種"，天生就喜歡和同源的 HC:LC 配對；而另一些則是 "大眾情人"，在 HC:LC 配對上顯得比較隨意。研究發(fā)現，這種配對偏好主要由 CDR 決定，這些發(fā)現或許能幫我們在選擇兼容的 HC:LC 對或尋找常見(jiàn) LC 時(shí)少走彎路。

       要是想從根本上避免 HC:LC 錯配的問(wèn)題，還有個(gè)簡(jiǎn)單粗暴的方法：用 scFv 片段或 sdAb 等抗體片段替換一個(gè)或兩個(gè) Fab，讓 bsAb 最多只帶一個(gè) LC，這樣就從源頭上杜絕了錯配的可能，堪稱(chēng) "釜底抽薪"。

       由于 bsAb 正確鏈配對太重要了，人們對高級分析和高效下游純化工藝的興趣也日益濃厚，畢竟得準確找出并清除那些 "錯配分子"，還得給它們定量呢。

       替代鏈轉向

       除了上面說(shuō)的組裝方法，人們還探索了一些更依賴(lài)化學(xué)處理的策略，算是 "化學(xué)媒人" 的功勞。比如表達一種 IgG 樣 bsAb，它由 4 條不同的多肽鏈組成，以單一構建體的形式表達?？贵w鏈之間通過(guò)連接子連接，這個(gè)連接子就像個(gè) "指揮家"，控制著(zhù)鏈的組裝，而且在表達后還能被去掉。給 BsAb 鏈加上亮氨酸拉鏈也能控制它們的結合，全長(cháng) IgG 分子還能通過(guò) SpyTag/SpyCatcher 系統或者點(diǎn)擊化學(xué) "牽手成功"。

       分子幾何構形

       BsAb 可不僅僅是各個(gè)部分的簡(jiǎn)單相加，選擇最佳的分子結構就像給房子選戶(hù)型，是獲得所需功能的關(guān)鍵設計考量。這意味著(zhù)由相同分子構建塊組成（總氨基酸含量相同），只是分子幾何形狀不同的 BsAb，可能會(huì )表現出天差地別的活性。

       雙重靶向通常是個(gè)復雜的活兒，因為 BsAb 的配置得同時(shí)考慮內部和外部限制才能達到預期的治療效果。內部限制是分子幾何形狀自身帶來(lái)的，比如結合域之間的空間位阻，就像兩個(gè)人站得太近會(huì )互相妨礙一樣。有研究檢查了一整套對稱(chēng)的 sdAb-IgG bsAb，包括鏡像特異性，發(fā)現抗原結合域的結合親和力會(huì )受到分子幾何結構導致的域間空間位阻影響，而且當 sdAb 與 LC 連接時(shí)，這種影響比與 HC連接時(shí)更明顯。不過(guò)，這種內部限制可以通過(guò)結構工程來(lái)緩解，比如延長(cháng)連接子，增加分子內的靈活性和靶標結合之間的距離，就像把兩個(gè)吵架的人拉開(kāi)點(diǎn)距離。

       外部限制則是由靶環(huán)境的空間組織造成的，BsAb 得擺出特定的 "姿勢" 才能實(shí)現所需的時(shí)空靶標結合。對于有細胞間活性的 BsAb 來(lái)說(shuō)，這種外部限制尤為明顯，畢竟細胞表面受體的空間結構本身就很復雜。比如，T 細胞活化所需的免疫突觸，就取決于 T 細胞抗原受體和肽 - MHC 配體的間距。既然通過(guò) T 細胞重定向 BsAb 建立的人工免疫突觸和天然免疫突觸長(cháng)得很像，那在設計這些 T 細胞重定向 BsAb 時(shí)，就得參考自然間距的限制，別搞 "非主流"。

       再舉個(gè)例子，當 Fynomer（源自 Fyn 激酶 SH3 結構域的小結合蛋白）連接在 N端而不是 C 端時(shí)，FynomAbs 的細胞毒活性更高。這說(shuō)明，通過(guò)調整分子幾何形狀來(lái)實(shí)現最佳的位間定位，效果可能出奇地好。如果短位點(diǎn)間距更有利，那基于小片段的配置或許是個(gè)不錯的選擇。同樣，合理設計分子結構和抗原結合域的位點(diǎn)間距，還能影響作用機理。在 T 細胞結合 scFv-IgG bsAb 中就得到了證實(shí)，將 scFv C 末端融合到 LC 上獲得的較短位點(diǎn)間距，在體外和體內都展現出了更優(yōu)異的抗腫瘤效果。而且，靶向 CD19 和 CD3 的基于片段的 DART 分子，比由相同結合域組成的串聯(lián) scFv 表現出更好的細胞裂解作用，看來(lái) DART 分子更緊湊的 "身材" 有利于維持細胞間接觸。

       受體空間組織的重要性，讓人們開(kāi)始關(guān)注受體：抗體復合物的結構分析，希望能揭開(kāi)有效抗體結合的秘密，從而設計出更棒的抗體療法。其實(shí)，位間距離不僅在細胞間靶向中很重要，對于兩個(gè)表位都在同一靶細胞上的 bsAb 也同樣關(guān)鍵。比如，雙位抗 HER2 bsAb 在非活性交聯(lián)構象中有效捕獲 HER2 的能力，就很大程度上取決于分子幾何形狀，就像用合適的網(wǎng)才能網(wǎng)住特定的魚(yú)。

       鑒于 bsAb 結構的影響這么大，想知道哪種 bsAb 最有效，光分析親本單特異性抗體可不夠。所以，我們得努力開(kāi)發(fā)功能性篩選策略，不僅要評估親本抗體的結合能力，還得篩選組合 bsAb 組，看看哪種分子結構和抗原結合域的組合最搭。

       而且，影響 bsAb 效力的不只是分子幾何形狀，還有特異性的相對方向。比如，把抗 HER2 scFv 與抗 PD1 IgG 支架融合，和反過(guò)來(lái)把抗 PD1 scFv 與抗 HER2IgG 融合相比，HER2 的結合率明顯降低，這說(shuō)明 "誰(shuí)站前面誰(shuí)站后面" 影響還挺大?；谄蔚?bsAb 也有類(lèi)似的情況，相對方向不同，效果可能就差遠了。

       在 bsAb 的設計中，不僅要優(yōu)化分子構型和價(jià)態(tài)來(lái)達到所需的作用機制（MOA），還得優(yōu)化不同抗原結合臂之間的相對結合親和力。這可能就需要評估各種親和力變體的組合，才能找到最佳搭配，就像調配雞尾酒，比例對了味道才好。

       平衡結合親和力的重要性，讓人們對機制建模產(chǎn)生了興趣，希望通過(guò)它理解親和力相互作用，從而更科學(xué)地設計 BsAb。這種親和力調節對于靶向 CD3 和腫瘤相關(guān)抗原的 T 細胞結合 BsAb 來(lái)說(shuō)尤其重要，而且相對結合親和力已經(jīng)被證明會(huì )影響療效和選擇性，可不能馬虎。

       可開(kāi)發(fā)性考慮

       可開(kāi)發(fā)性這檔子事，光讓雙特異性抗體（bsAbs）像神槍手一樣精準結合抗原還不夠，它還得具備一身 "好藥相"-- 比如表達量得像打了雞血一樣飆升，穩定性得堪比老陳醋越放越香，別動(dòng)不動(dòng)就自己抱成一團（自交聯(lián)和聚集），溶解度也得給力不能掉鏈子。這些特質(zhì)合在一起，我們管它叫 "可開(kāi)發(fā)性特征"。就像相親前得先看看照片篩一輪，藥物開(kāi)發(fā)早期也得給 bsAbs 做個(gè)可開(kāi)發(fā)性體檢，免得辛辛苦苦砸了錢(qián)，最后發(fā)現這貨根本成不了臨床候選的 "潛力股"。

       現在大伙兒都在忙著(zhù)搞計算機預測工具和高通量分析，想在早期就揪出那些 "先天不足" 的候選者。但問(wèn)題是，這些方法大多是給傳統單克隆抗體制訂的 "體檢標準"，用到 bsAbs 身上就得格外留神了 -- 畢竟給 bsAbs 搞工程改造時(shí)，很可能一不小心就捅出些意想不到的 "簍子"。比如說(shuō)，我們最近就發(fā)現，把單鏈抗體（sdAb）嫁接到 IgG 這個(gè) "支架" 上，表達量和穩定性立馬就變了臉，而且變得有多離譜，全看分子的 "身材比例"、單鏈抗體接在 IgG 的哪個(gè) "部位"，還有接上去的 "零件" 數量。這研究算是把話(huà)挑明了：分子的 "顏值即正義"（最佳幾何結構）有多重要，單鏈抗體的 "體質(zhì)" 可不能光看單個(gè)零件或者它 "爹媽"（親本抗體）怎么樣就下結論。

       bsAbs 的 "造型設計" 可能引發(fā)的其他 "健康問(wèn)題" 還不少，比如動(dòng)不動(dòng)就碎成幾段（碎片化）、特別愛(ài)扎堆（聚集傾向），還有工程改造出來(lái)的二硫鍵可能一言不合就 "鬧離婚"（還原）又 "復婚"（再氧化）。所以說(shuō)，分子的 "身材" 在化學(xué)和生物物理穩定性這兩塊，絕 對是設計時(shí)的重中之重。

       不光如此，分子的 "穿搭風(fēng)格"（形式）還會(huì )影響 bsAbs 在體內的 "保質(zhì)期"（藥代動(dòng)力學(xué)），大伙兒也在想辦法搞出能預測這一點(diǎn)的體外檢測方法。但架不住 bsAbs 的 "穿搭" 實(shí)在太多樣了，各種形式和 "身材" 讓人眼花繚亂，以至于到現在都沒(méi)法給它們的可開(kāi)發(fā)性畫(huà)個(gè)統一的 "標準像"。

       雖然搞大規模的系統研究，說(shuō)不定能總結出各種 "穿搭" 和 "身材" 的共同規律，但目前的做法通常是：要么在專(zhuān)利平臺的 "圈子里"，通過(guò)組合庫高通量篩選或者多參數優(yōu)化，找出那些 "體質(zhì)" 不錯的 bsAbs；要么就是走 "捷徑"-- 把單個(gè)表達的抗體組分用生物偶聯(lián)的方式拼起來(lái)，不用費勁吧啦地逐個(gè)生產(chǎn)，就能攢出一大堆 bsAbs 來(lái)篩選，這操作簡(jiǎn)直是 "搭積木式" 高效。

       要是想針對性改善 bsAbs 的 "體質(zhì)"，就得對那些 "拖后腿" 的片段下功夫優(yōu)化。比如給片段 "強身健體"，讓它更耐熱、更易溶、化學(xué)性質(zhì)更穩定，也別老想著(zhù) "抱團取暖"。但關(guān)鍵是，優(yōu)化完之后還得把它放回完整的 bsAbs 里再測一遍，免得 "單個(gè)零件給力，組裝起來(lái)掉鏈子"。

       對 "藥相" 的要求也能提前融入發(fā)現過(guò)程，比如在篩選的時(shí)候就給 "好藥相" 設點(diǎn) "加分項"。

       結論

       雙特異性抗體（bsAbs）絕 對是治療界的 "潛力新星"，在各種醫療場(chǎng)景里都憋著(zhù)一股狠勁想大顯身手。但這貨能不能成，全看設計和構建夠不夠給力 -- 既得讓它治病夠猛，又得讓它的理化性質(zhì)夠乖，這平衡可得拿捏準了。

       就像前面說(shuō)的，bsAbs 的 "戰斗力" 和 "表現分" 之間的關(guān)系錯綜復雜，全看它的 "結構造型" 給不給力?，F在大伙兒都在使勁兒設計那種既能雙靶點(diǎn) "開(kāi)黑"，又能滿(mǎn)足開(kāi)發(fā)要求，甚至能超越傳統單特異性抗體的 bsAbs。

       這篇文章掏心窩子分享的這些見(jiàn)解，就是想說(shuō)明白 bsAbs 工程有多 "燒腦"，也想強調一句：想讓它的治療潛力徹底爆發(fā)，戰略設計這步棋必須走對。值得一提的是，我們深挖了工程策略和實(shí)際考量里的那些 "彎彎繞繞"，就是想弄清楚高效 bsAbs 設計里藏著(zhù)的那些 "坑" 和 "機遇"。把這些設計原則的復雜門(mén)道捋清楚了，就能給 bsAbs 作為多功能 "治療利器" 的持續進(jìn)化添磚加瓦，也能給未來(lái)更牛的 bsAb 療法研究開(kāi)發(fā)指條明路。

       原文來(lái)源：A.V.Madsen, L.E.Pedersen, P.Kristensen, et al., Design and engineering of bispecific antibodies: insights and practical considerations. Front. Bioeng. Biotechnol., 2024.