抗體生產(chǎn)成本有望降低到15美元/克以下

       21世紀被稱(chēng)為生命科學(xué)和生物技術(shù)的時(shí)代，生物制藥行業(yè)在過(guò)去的20年間有了長(cháng)足的發(fā)展，特別是抗體類(lèi)藥物的銷(xiāo)售額逐年攀升。目前，大部分抗體類(lèi)產(chǎn)品是以batch或fed-batch的模式進(jìn)行細胞培養和表達。隨著(zhù)多個(gè)重磅原研生物藥的專(zhuān)利到期，為了滿(mǎn)足臨床未及的需求和降低原研生物藥的昂貴醫療費用，越來(lái)越多的制藥企業(yè)進(jìn)入生物類(lèi)似藥的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，這進(jìn)一步加劇了生物類(lèi)似藥的競爭，企業(yè)成本壓力日益凸顯，因此，越來(lái)越多的制藥企業(yè)將上、下游工藝由批次生產(chǎn)向連續生產(chǎn)轉移，以此獲得更高的抗體產(chǎn)量。

       圖1 抗體藥物生產(chǎn)工藝流程圖

       一份成本研究報告表明，單抗產(chǎn)品從批次轉到連續生產(chǎn)將會(huì )節省70%的生產(chǎn)成本投入。2017年11月2日，藥明生物與頗爾公司宣布在上海創(chuàng )建聯(lián)合實(shí)驗室，攜手開(kāi)發(fā)完整的單克隆抗體連續生產(chǎn)工藝。通過(guò)此次聯(lián)合實(shí)驗室的合作，藥明生物計劃近期將該工藝放大至500升規模，抗體生產(chǎn)成本則降至30-50美元/克；之后將放大到多個(gè)1000升規模，抗體生產(chǎn)成本便有望降低到15美元/克以下。

       包括FDA、EMA和PMDA在內的法規監管部門(mén)都支持連續流生產(chǎn)工藝這種生產(chǎn)方式的革新，接受連續流生產(chǎn)的藥物制品。監管部門(mén)認為，連續流生產(chǎn)的好處在于更少操作步驟的集成化生產(chǎn)過(guò)程，需要更少的設備和設施，同時(shí)這種新興的技術(shù)適用QbD的工藝設計原則，有潛力提供更高的生產(chǎn)效率，有的靈活性。監管部門(mén)對于連續生產(chǎn)工藝適用于現有的法規監管體系達成共識，對于連續生產(chǎn)工藝沒(méi)有特殊的法規要求。同時(shí)，FDA、EMA 和PMDA等部門(mén)都有專(zhuān)門(mén)的新技術(shù)團隊來(lái)鼓勵和幫助新技術(shù)的實(shí)施和應用。2017年，美國食品藥品監督管理局（FDA）批準了幾項連續流的生產(chǎn)，正在積極推動(dòng)醫藥行業(yè)接受這項新技術(shù)。FDA認為使用連續流生產(chǎn)技術(shù)可以降低生產(chǎn)中的人為差錯，提高藥品質(zhì)量。

       越來(lái)越多的制藥公司都在嘗試連續流的生產(chǎn)，并且認為連續生產(chǎn)對生物藥品生產(chǎn)能帶來(lái)諸多好處：（1）從上游開(kāi)始的連續性生產(chǎn)工藝可節省占地空間、減少固定資產(chǎn)投入、提高單位時(shí)間生產(chǎn)效率；（2）模塊化的操作集成一次性產(chǎn)品使得工藝靈活高效，可多地復制生產(chǎn)，符合不同地區的監管標準?？贵w藥物行業(yè)連續生產(chǎn)的新技術(shù)從上游發(fā)酵貫穿到下游純化至原液制備，現階段已經(jīng)可以應用在藥物研發(fā)和生產(chǎn)的連續工藝技術(shù)主要包括連續灌流生產(chǎn)、連續細胞澄清、連續流層析、在線(xiàn)病毒滅活、在線(xiàn)濃縮與在線(xiàn)洗濾等。

       【連續灌流培養技術(shù)】

       連續灌流培養技術(shù)是指接種后新培養基的持續加入，含有產(chǎn)品的培養基持續收獲，細胞截留裝置將細胞保留在反應器中。相對于批次培養，灌流培養從根本上解決營(yíng)養物耗竭和代謝副產(chǎn)物積累之間的矛盾，極大地提高培養過(guò)程中的細胞密度、延長(cháng)培養周期，提高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。凝血因子VIII是第一個(gè)獲得批準的采用灌注工藝生產(chǎn)的生物藥物，生產(chǎn)周期達到185天，細胞密度和凝血因子VIII產(chǎn)能與批式培養相比可提高30倍。按上述結果計算一個(gè)100-500L的反應器就可達到批式培養3000-15000L反應器的生產(chǎn)能力，大大降低了對工廠(chǎng)規模的要求，Clincke等在10 L的WAVE反應器中通過(guò)使用ATF截留系統培養CHO細胞，細胞密度達到了2.14×108cells/ml，經(jīng)過(guò)12天的培養，抗體濃度達到了3g/L。

       連續灌流培養技術(shù)是一個(gè)復雜的體系，很多條件共同起作用，從而改善細胞培養效果，如合適的培養基、灌流策略以及截留方式等，其中生物反應器內的細胞截留方式也是一個(gè)需要考慮的重要環(huán)節。當新鮮培養基持續補充的同時(shí)，含有代謝產(chǎn)物的舊培養基也需要不斷地從反應器內移出，以保證培養體積和環(huán)境穩定。同時(shí)，在細胞密度不斷增加時(shí)，需要相應地提高灌流速率來(lái)滿(mǎn)足細胞對營(yíng)養物質(zhì)的快速消耗，普通的截留裝置在高流速、粘度的料液中極易發(fā)生堵塞，造成培養無(wú)法正常繼續下去。目前應用較多的分離技術(shù)有Wave Lily pad截留膜技術(shù)、中空纖維（ Hollow Fiber）技術(shù)、連續流離心機技術(shù)及超聲細胞分離技術(shù)。

       圖2 連續灌流培養示意圖

       通過(guò)連續灌流培養技術(shù)延長(cháng)培養時(shí)間，可獲得更高的細胞密度，增加蛋白表達量，同時(shí)目的產(chǎn)物在生物反應器更短的滯留時(shí)間有利于維持產(chǎn)物的質(zhì)量。在實(shí)際生產(chǎn)應用中，灌流工藝可以減小設備的尺寸和提高單位體積的產(chǎn)率，可將上游生產(chǎn)和下游純化整合到一起，更有利于一次性技術(shù)平臺的搭建，從而降低相應的設備及廠(chǎng)房固定資產(chǎn)投入。

       【連續細胞培養液澄清】

       連續細胞培養液澄清是連續生產(chǎn)工藝中的關(guān)鍵步驟，目前主要的手段有連續流離心、切向流膜過(guò)濾和基于聲波原理的分離方法。

       連續流離心能夠有效的去除細胞和大細胞碎片，但是在離心過(guò)程中細胞可能會(huì )被破壞，在離心中許多亞微米大小的顆粒不能被去除，這樣就增加了后續的深度過(guò)濾的負擔。

       膜過(guò)濾技術(shù)一直被廣泛應用于固液分離，但是膜堵塞一直是這項技術(shù)中一直存在的難點(diǎn)。切向流膜過(guò)濾技術(shù)通過(guò)引入切向的沖刷作用，實(shí)現了料液的長(cháng)時(shí)間循環(huán)，從而被廣泛運用于灌流工藝中。

       基于聲學(xué)分離原理，細胞培養液的澄清實(shí)現了一種全新的可放大的一次性技術(shù)，這種技術(shù)是使用低頻聲波產(chǎn)生一個(gè)貫穿流道的3D聲波，當細胞進(jìn)入帶有串聯(lián)的帶有聲波發(fā)生器的腔室，細胞及細胞碎片被聲波作用捕獲，然后細胞遷徙到駐波節點(diǎn)，并開(kāi)始聚集在一起，最后聚集細胞由于浮力降低，在重力作用下從懸浮液中沉降下來(lái)，設備所濾出的物料即為澄清后的細胞培養液。這種聲學(xué)原理澄清方式的產(chǎn)出物質(zhì)量和離心方案相同，但解決了離心方案中占地空間需求高及清潔驗證復雜的問(wèn)題。同時(shí)，從聲學(xué)分離器濾出的濁度下降的同時(shí)也減少了二級澄清所需深層濾板及后續生物負載控制過(guò)濾的過(guò)濾面積需求。

       【連續流層析技術(shù)】

       傳統的下游純化是以批次方式進(jìn)行，產(chǎn)品的結合、洗脫等純化操作都是在單一層析柱中完成。填裝后的柱床為避免產(chǎn)品過(guò)載，層析介質(zhì)的利用率僅為其靜態(tài)載量的50-70%。為適應上游表達量的提升，通常會(huì )選擇單柱多循環(huán)層析。

       應對上游灌流連續生產(chǎn)和批次生產(chǎn)日益提高的表達量，下游的純化方式也從批次向連續純化轉變。連續流層析技術(shù)是使用一系列互相連接且顯著(zhù)變小的層析柱，在短的接觸時(shí)間內，以過(guò)載上樣的方式進(jìn)行樣品純化的生產(chǎn)方式。層析柱在上樣與非上樣過(guò)程之間切換，每個(gè)上樣過(guò)程包含兩根層析柱，以保證前上樣柱在達到一定的樣品流穿水平后及上樣后沖洗過(guò)程中，流穿樣品完全被后根層析柱吸附，非上樣層析柱同時(shí)執行洗脫、清洗、及平衡過(guò)程。上樣與非上樣步驟的同時(shí)進(jìn)行可大幅縮短工藝時(shí)間，縮小設備規模并較少緩沖液用量。同時(shí)，連續層析過(guò)載上樣能提高介質(zhì)的利用效率，小規模層析柱短的接觸時(shí)間能顯著(zhù)提高生產(chǎn)效率（g/l/hr），更小的操作單元集成一次性技術(shù)使得連續層析技術(shù)有極高的靈活性，與傳統批處理相比，它可提高介質(zhì)使用率40-60%；此外還可使產(chǎn)量提高2倍。另一方面，由于連續流層析技術(shù)可以更快的純化出活性大分子，該項技術(shù)也被應用于純化相對不穩定的蛋白，例如酶類(lèi)或者重組凝血因子類(lèi)蛋白。連續層析技術(shù)適用于不同的分離方式，在抗體純化領(lǐng)域，已有供應商提供多柱位連續流層析產(chǎn)品，如GE ?KTA pcc75可在同一臺設備上同時(shí)進(jìn)行陰、陽(yáng)離子兩步層析操作，使得抗體產(chǎn)品下游純化實(shí)現全過(guò)程的連續生產(chǎn)。

       當然，連續流層析技術(shù)的應用還面臨工藝上的幾個(gè)難點(diǎn)：第一，如何自動(dòng)化控制以滿(mǎn)足整個(gè)生產(chǎn)周期中不穩定的上游料液變化；第二，如何保證層析填料能夠在整個(gè)生產(chǎn)周期中保持穩定的分離效果；第三，如何有效實(shí)現無(wú)菌工藝。目前，生物制藥行業(yè)已有藥品生產(chǎn)企業(yè)應用連續層析技術(shù)生產(chǎn)的藥品進(jìn)行臨床申報，賽諾菲也在研究該技術(shù)在**領(lǐng)域中的應用。

       【在線(xiàn)濃縮技術(shù)】

       在線(xiàn)濃縮技術(shù)又稱(chēng)為單向切向流過(guò)濾技術(shù)，特殊設計的膜包流路使得料液?jiǎn)蜗蛲ㄟ^(guò)膜材可濃縮4-6倍。該連續生產(chǎn)工藝的突出優(yōu)勢在于節省了每個(gè)單元操作間的大體積存儲容器，減少了系統的死體積并提高了產(chǎn)品的回收率，最終節省了占地空間。在線(xiàn)濃縮裝置在連續生產(chǎn)過(guò)程中可用于細胞液澄清后的濃縮，減少層析上樣量，提高連續流層析單位時(shí)間產(chǎn)率，較批次生產(chǎn)效率提高5倍以上。在線(xiàn)濃縮裝置在連續生產(chǎn)過(guò)程中還可用于最后原液產(chǎn)品的制備，2套在線(xiàn)濃縮裝置串聯(lián)使用，可達到40倍的連續濃縮效果。

       連續生產(chǎn)技術(shù)有多種實(shí)現方式，主要分為：（1）上游到下游的全連續生產(chǎn)模式，每一個(gè)單元間藥液持續運行；（2）端到端的連續生產(chǎn)模式，進(jìn)料和出料是連續生產(chǎn)，中間操作單元可以是批次方式。（3）雜合的連續生產(chǎn)模式，部分生產(chǎn)工藝為連續，其他部分為批次形式。目前，全連續生產(chǎn)所需的在線(xiàn)稀釋、在線(xiàn)病毒滅活、在線(xiàn)洗濾等技術(shù)也在持續研發(fā)中，相信不久的將來(lái)將會(huì )實(shí)現完整的抗體藥物全連續生產(chǎn)。

       作者簡(jiǎn)介：張功臣，制藥行業(yè)專(zhuān)家，主要從事制藥用水系統、無(wú)菌與生物工藝系統的研究與實(shí)踐。全國大學(xué)生制藥工程設計競賽委員會(huì )專(zhuān)家，國際制藥工程協(xié)會(huì )（ISPE）培訓專(zhuān)家，國家藥品監督管理局檢查員培訓專(zhuān)家，中國藥典通則0261制藥用水課題組專(zhuān)家，國家標準《GB50913-2013 醫藥工藝用水系統設計規范》編委。