RNA藥物旨在通過(guò)基因的表達、沉默等功能治療疾病，基因治療被業(yè)界認為是繼化學(xué)小分子藥物、生物大分子藥物之后的第三代治療藥物。寡核苷酸由人工合成小于100 nt (nucleotides)的修飾RNA或DNA單鏈或雙鏈，包括反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、微小RNA (miRNA)、適配體(Aptamer)、未甲基化CpG的寡核苷酸等。由于siRNA藥物療效較好、技術(shù)取得突破，目前最受關(guān)注。siRNA是一類(lèi)雙鏈RNA分子，長(cháng)度為20-25個(gè)堿基對， 通過(guò)與體內相關(guān)酶形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex,RISC）降解目標mRNA，調低或抑制目標基因的表達。

       目前批準的5款siRNA上市藥物總結如下。5款siRNA上市藥物，其中有四款來(lái)自Alnylam公司，Inclisiran是Alnylam 轉讓給諾華。治療領(lǐng)域主要位內分泌于代謝、神經(jīng)、泌尿、心血管系統，靶向均是肝臟，除了Onpattro給藥方式為靜脈輸注，其它均為皮下注射，均進(jìn)行了核糖修飾和/或骨架修飾，除了Onpattro遞送方式為L(cháng)NP，其它均為GalNAc，分子量為14或17kD。

       圖1 五款siRNA上市藥物（截止2023.11）

       已上市的5款siRNA藥物均使用了化學(xué)修飾和遞送系統。因siRNA自身的物理化學(xué)特性，未經(jīng)修飾的游離寡核苷酸類(lèi)藥物在給藥后不僅會(huì )很快被機體清除，同時(shí)還有脫靶和產(chǎn)生毒副作用的風(fēng)險。因此需要同時(shí)借助化學(xué)修飾和合適的遞送系統來(lái)達到治療目的。關(guān)于化學(xué)修飾，第一代化學(xué)修飾是對磷酸骨架的修飾，如硫代磷酸酯（PS）。第二代化學(xué)修飾是核糖修飾，其中2-O-甲基（2-OMe）、2-O-甲氧基-乙基（2-MOE）和2-氟（2-F）修飾是最常用的類(lèi)型。第三代化學(xué)修飾為核糖五元環(huán)改造，總結如下：

       圖2 siRNA化學(xué)修飾

       單純通過(guò)化學(xué)修飾還是很難使siRNA到達靶部位。因此，遞送系統成了寡核苷酸藥物研發(fā)中成功的關(guān)鍵，也是藥物研發(fā)公司的技術(shù)護城河。目前已上市的5款siRNA藥物，使用的遞送系統為L(cháng)NP（左圖）和GalNAc（右圖）。LNP主要由五部分組成：可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂、PEG-脂質(zhì)。其中，電離陽(yáng)離子脂質(zhì)是最關(guān)鍵的輔料，是siRNA遞送的決定性因素。它在不同的pH條件下表現出不同的帶電特征，在酸性pH值條件下帶正電荷，而在生理pH條件下基本呈中性。脂材的可離子化特性為siRNA跨越生物屏障提供了智能化的保護。目前已上市的4款GalNAc-siRNA偶聯(lián)物均使用L96作為載體，結構均由3部分組成，分別為三觸GalNAc靶頭、連接臂以及siRNA分子。GalNAc以三價(jià)態(tài)的方式共價(jià)偶聯(lián)至核酸3'末端，形成GalNAc-siRNA偶聯(lián)物。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受體 (ASGPR) 的配體，ASGPR在肝細胞的膜表面高度特異性表達。GalNAc-siRNA偶聯(lián)物通過(guò)特異性結合ASGPR，在內吞作用下，將siRNA從細胞表面轉運至細胞中。 隨后GalNAc-siRNA偶聯(lián)物與ASPGR分離，ASPRGR回到細胞表面，而GalNAc-siRNA偶聯(lián)物進(jìn)一步解離，釋放出的游離siRNA在細胞質(zhì)中沉默基因發(fā)揮藥效。

       圖3 遞送系統LNP, GalNAc

       寡核苷酸是化學(xué)合成藥物，雖具備生物制品屬性，但按新化學(xué)實(shí)體監管。寡核苷酸按新化學(xué)實(shí)體監管，不僅人們的科學(xué)認知尚存在一些缺口，從新藥注冊申報的角度，也存在一些監管指南空缺。目前國內尚無(wú)相關(guān)指導原則。除了ICH 系列指導原則外（ICH S6/M3/S7/S2）, 日本PMDA 2020年發(fā)布了《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評價(jià)指導原則》可供參考；FDA也發(fā)布了用于工業(yè)界的相關(guān)指導原則，如寡核苷酸治療藥物開(kāi)發(fā)的臨床藥理學(xué)考慮等。根據日本藥監局2020年發(fā)布的《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評價(jià)》指導原則，siRNA藥物種屬選擇策略如下。目前已上市的5款siRNA，種屬均是大鼠、食蟹猴。非嚙齒動(dòng)物選猴的主要原因如下：猴和人的目標mRNA具有高度或完全同源性，猴種屬可以更好地評估siRNA放大的藥理學(xué)效應。

       圖4 種屬選擇

       根據已上市的5款siRNA藥物，臨床前安評總結如下。

       圖5 五款siRNA藥物臨床前安評總結

       以遞送系統LNP藥物Patisiran，遞送系統GalNAc藥物Inclisiran為代表，分析臨床前安評結果。Patisiran是Alnylam研發(fā)，于2018.8 FDA批準首 款siRNA藥物。適應癥為遺傳性轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）引起的周?chē)窠?jīng)疾病，靶點(diǎn)TTR（轉甲狀腺素蛋白）。臨床給藥途徑，頻率：靜脈滴注，3周一次, 0.3 mg/kg。遞送載體LNP，通過(guò)RNA干擾引起突變型和野生型TTR mRNA的降解，從而導致血清TTR蛋白和組織中TTR蛋白沉積的減少。Patisiran臨床前安評結果總結如下：

       圖6 Patisiran臨床前安評總結

       圖7 Patisiran臨床前安評總結（續）

       Inclisiran研發(fā)公司Novartis/Alnylam，于2020.12歐盟首次獲批，全球首 個(gè) siRNA降膽固醇療法藥物，適應癥原發(fā)性高膽固醇血癥或混合性血脂異常，靶點(diǎn)PCSK9。臨床給藥途徑、頻率: 皮下注射，第0、3個(gè)月各給藥一次后，維持期6個(gè)月一次，一年只需2次。遞送系統GaINAc，作用機制Leqvio可與編碼PCSK9蛋白的mRNA結合，通過(guò)RNA的干擾作用來(lái)防止肝臟生成PCSK9蛋白。Inclisiran臨床前安評結果總結如下：

       圖8 Inclisiran臨床前安評總結

       圖9 Inclisiran臨床前安評總結（續）

       為了探究已上市的5款siRNA非臨床毒性和臨床主要不良反應是否有關(guān)聯(lián)性，通過(guò)整理支持NDA的NHP 長(cháng)毒試驗毒性結果，以及臨床警告和注意事項，非臨床和臨床關(guān)聯(lián)性較強的是肝臟毒性，需要關(guān)注血生化一些指標變化，如ALT, AST。

       圖10 Inclisiran臨床前安評總結（續）

       已上市5款siRNA藥物，進(jìn)行了免疫毒性考察，如抗藥抗體、細胞因子、補體、免疫表型。結果總結如下：

       圖11 五款siRNA藥物免疫毒性結果總結

       理論上講，若siRNA和靶mRNA準確地結合在一起，則可成功的沉默靶基因。然而，許多siRNA都存在siRNA脫靶，并且大多數siRNA分子可能并不像以前認為的那樣具有特異性。siRNA的引入可導致脫靶效應，即抑制目標基因靶標以外的基因，導致危險的基因表達突變和意外后果。根據日本發(fā)布的《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評價(jià)指導原則》，寡核苷酸的毒性分析分為靶向毒性。脫靶毒性。靶向毒性指靶點(diǎn)相關(guān)的藥理學(xué)活性放大所引起的毒性反應；脫靶毒性分為雜交依賴(lài)、非雜交依賴(lài)。雜交依賴(lài)脫靶毒性指與靶序列相似的序列雜交而產(chǎn)生的脫靶效應，非雜交依賴(lài)脫靶毒性指不依賴(lài)于雜交，由分子結構和物理/化學(xué)性質(zhì)所引起的脫靶毒性。雜交和序列相關(guān)因素，應在藥物設計時(shí)應被優(yōu)先考慮。靶向毒性的評估主要依賴(lài)于收集有關(guān)靶向的生物功能、組織表達模式的可用信息，以及來(lái)自同一靶向的其他藥物的公開(kāi)信息。雜交依賴(lài)脫靶毒性建議采用生物信息學(xué)的方法、體外考察人源細胞基因表達的方法，進(jìn)行評價(jià)，非雜交依賴(lài)脫靶毒性由于來(lái)自其物理、化學(xué)性質(zhì)，建議參考化學(xué)藥物非臨床評價(jià)的一般要求。

       已上市5款siRNA藥物均有肝靶向性，目前LNP組織靶向主要局限于肝臟，IV后80%-90%的LNP會(huì )進(jìn)入肝臟，最終被肝細胞吸收；GalNAc-siRNA經(jīng)ASGPR介導發(fā)生細胞內吞而進(jìn)入靶組織， ASGPR在肝細胞上大量表達。組織分布結果均顯示肝臟濃度最高，如Lumasiran 猴10mg/kg時(shí)，AUC 76700h*μg/mL, 且消除半衰期長(cháng)， 高達409h。用于支持NDA的猴長(cháng)毒試驗中，組織病理均發(fā)現肝臟變化（無(wú)腎臟變化），從輕到重依次是：（1）肝細胞/枯否細胞嗜堿性顆粒：可能為供試品或其代謝產(chǎn)物*，可能是細胞攝取寡核苷酸的適應性改變；（2）肝細胞空泡化：可能為繼發(fā)于胞漿內嗜堿性顆粒蓄積的改變；（3）炎癥浸潤：高濃度藥物分布時(shí)，會(huì )激活促炎性通路（4）肝細胞單細胞壞死：高劑量下嗜堿性顆粒大量蓄積時(shí)可觀(guān)察到病理?yè)p傷，如肝細胞壞死。此外，大部分藥物還伴隨血生化臨檢指標變化，如ALT, AST升高。是否是有害變化，要根據是否對組織本身?yè)p傷，是否引相關(guān)的指標變化，是否可恢復，其它的siRNA藥物是否有類(lèi)似改變等綜合判斷。

       除了肝毒性，序列相關(guān)引起的脫靶毒性，還有免疫刺激反應，其毒性在很大程度上取決于核苷酸序列設計和化學(xué)修飾。siRNA藥物通過(guò)激活先天免疫系統，導致注射部位反應(如Patisiran，Inclisiran)、血小板（PLT）減少(如Patisiran, Givosiran)。免疫刺激評估，可在體外用分離的外周血單核細胞或全血測定預測細胞因子釋放來(lái)評估。

       雜交與序列均無(wú)關(guān)毒性，如凝血功能改變，siRNA藥物通過(guò)抑制凝血級聯(lián)反應中的因子IXa和輔助因子VIIIa，進(jìn)而選擇性的抑制了部分凝血酶的作用時(shí)間，從而以一種與雜交和序列無(wú)關(guān)的方式抑制凝血（如Patisiran，Lumasiran APTT輕微升高）。此外，siRNA藥物還可以結合抑制性因子H激活補體旁路，補體過(guò)度激活可使補體功能改變，引發(fā)繼發(fā)性炎癥和血管炎等（如Patisiran C3a升高，發(fā)現肝臟炎癥浸潤、輸注部位血管周?chē)装Y）。

       2018年第一款siRNA藥物Onpattro獲批，對siRNA藥物領(lǐng)域有巨大的振奮作用，是諾貝爾獎成果從概念走向實(shí)際治療用途的一個(gè)光輝里程碑。截止目前已有5款siRNA藥物上市，通過(guò)對五款已上市siRNA藥物臨床前安評總結分析，為此類(lèi)藥物臨床前方案設計提供一些參考。相信將來(lái)會(huì )有更多的siRNA藥物上市，相關(guān)的臨床前指導原則也會(huì )發(fā)布。

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       作者簡(jiǎn)介：磐盛，主要從事臨床前安評、項目管理等工作，負責過(guò)的藥物類(lèi)型有小分子，單抗，雙抗，多肽，ASO, siRNA, mRNA，ADC，疫苗等。通過(guò)項目管理，提供一體化新藥研發(fā)和申報解決方案，讓更多藥物獲批臨床，造福病患。