2019年12月18日，密切圍繞"國家藥品安全十三五規劃"的總體目標，以建立"最嚴謹的標準"為準則，對標國際先進(jìn)標準，國家藥典委員會(huì )官網(wǎng)發(fā)布2322《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法》（第三次征求意見(jiàn)稿），公示期為一個(gè)月，對中藥行業(yè)具有深遠的意義，由于中藥成分的復雜性，現行標準難以全面評價(jià)藥品質(zhì)量并發(fā)現潛在的質(zhì)量問(wèn)題，本文為大家梳理了汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法相關(guān)知識點(diǎn)。

       一、中藥材汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法現狀

       在中藥材重金屬及有害元素殘留控制方面，目前大多數國家藥典主要制定了汞、砷等殘留標準，2015版《中國藥典》在技術(shù)上實(shí)現了多種重金屬有害元素同時(shí)檢測，還首次針對重金屬在不同價(jià)態(tài)表現出不同的藥理和**作用的特點(diǎn)，探索制定了汞和砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法，可以說(shuō)在重金屬及有害元素檢測水平上開(kāi)始借鑒國際先進(jìn)經(jīng)驗和科學(xué)理念，更加注重與國際藥品通用性技術(shù)標準的統一協(xié)調。

       二、三版本《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法》對照看

       按照《中國藥典》2020年版編制工作進(jìn)度安排，2322《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法》第一、二、三次征求意見(jiàn)稿已分別于2018年11月、2019年5月、2019年12月在國家藥典委員會(huì )官網(wǎng)面向社會(huì )各界公開(kāi)征求意見(jiàn)，針對重金屬在不同價(jià)態(tài)表現出不同的藥理和**作用的特點(diǎn)，逐漸修訂完善了汞和砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法，可以說(shuō)在重金屬及有害元素檢測水平上，經(jīng)過(guò)修訂和完善，我國2020年版藥典可達到國際先進(jìn)的水平。

       紅色字體標注的為第一次征求意見(jiàn)稿修訂內容。

       淡橙色底紋標注的為第二次征求意見(jiàn)稿修訂內容。

       淡藍色底紋標注的為第三次征求意見(jiàn)稿修訂內容。

       2322   汞和、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法

       本法系采用高效液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜法測定供試品中汞或、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)。

       由于元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)分析的前處理方法與樣品密切相關(guān)，供試品溶液的制備方法如有特殊要求應在品種項下進(jìn)另行規定。

       一、汞元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法

       照高效液相色譜法-電感耦合等離子體質(zhì)譜測定法（通則0412）測定。

       色譜、質(zhì)譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（150mm×4.6mm，5µm）；以甲醇-0.01mol/L乙酸銨溶液（含0.12%L-半胱氨酸，氨水調節pH值至7.5）（8:92）為流動(dòng)相；流速為1.0ml/min。以具同軸霧化器和碰撞反應池的電感耦合等離子體質(zhì)譜（具碰撞反應池）進(jìn)行檢測；測定時(shí)選取同位素為²⁰²Hg，根據干擾情況選擇正常模式或碰撞池反應模式。3種不同形態(tài)汞及不同價(jià)態(tài)汞的分離度應大于1.5（圖1）。

       圖 1 汞元素形態(tài)及價(jià)態(tài)示意圖測定圖譜

       1.氯 化 汞（二價(jià)汞）；2.甲基汞；3.乙基汞

       對照品貯備溶液的制備 分別取氯 化 汞、甲基汞、乙基汞對照品適量，精密稱(chēng)定，再精密吸取汞元素標準溶液（1mg/ml，介質(zhì)類(lèi)型為硝酸）適量，加 8％甲醇制成每1ml各含100ng（均以汞計）的溶液，即得。

       標準曲線(xiàn)溶液的制備 精密吸取對照品貯備液適量，加8％甲醇分別制成每1ml各含0.5ng、1ng、5ng、10ng、20ng（均以汞計）系列濃度的溶液，即得。

       供試品溶液的制備 （1）礦物藥及其制劑：除另有規定外，取供試品適量，取相當于含汞量20～30mg的供試品粉末（過(guò)四號篩），精密稱(chēng)定，精密加入人工胃液或人工腸液適量，置37℃水浴中超聲處理適當時(shí)間，搖勻，取適量，靜置約2420～36小時(shí)，吸取中層溶液適量，用微孔濾膜（10μm）濾過(guò)，精密量取續濾液適量，用0.125mol/L鹽酸溶液稀釋至一定體積，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

       （2）動(dòng)、植物類(lèi)中藥（除甲類(lèi)、毛發(fā)類(lèi)）：除另有規定外，取供試品粉末（過(guò)三號篩）0.2～0.5g，精密稱(chēng)定，加0.1mol/L硝酸銀溶液200～600μl，精密加入硝酸人工胃液適量，置37～45℃水浴中加熱約20～24小時(shí)，取出，搖勻，室溫放置2小時(shí)，取上清液，用一次性雙層濾膜（10μm+3μm）濾過(guò)，取續濾液，即得。同法制備空白溶液。

       測定法 分別吸取系列標準曲線(xiàn)溶液和供試品溶液各20～100μl，注入液相色譜儀，測定。以系列標準曲線(xiàn)溶液中不同形態(tài)汞或不同價(jià)態(tài)汞的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線(xiàn)，計算供試品溶液中不同形態(tài)或不同價(jià)態(tài)汞的含量，即得。

       二、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法

       照高效液相色譜法-電感耦合等離子體質(zhì)譜測定法（通則0412）測定。

       色譜、質(zhì)譜條件與系統適用性試驗 以聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物載體鍵合三甲基銨陰離子交換材料或相當的材料為填充劑（250×4.1mm；10µm）；以0.025mol/L磷酸二氫銨溶液（氨水調節pH值至8.0）為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0ml/min。以具同軸霧化器和碰撞反應池的電感耦合等離子體質(zhì)譜進(jìn)行檢測；測定時(shí)選取同位素為⁷⁵As，選擇碰撞池反應模式或根據不同儀器的要求選用適宜校正方程進(jìn)行校正。

       6 種不同形態(tài)砷的分離度應符合要求，其中砷膽堿、砷甜菜堿和亞砷酸的分離度應不小于1.0（圖2）。

       圖 2 砷元素形態(tài)及價(jià)態(tài)示意圖測定圖譜

       1.砷膽堿；2.砷甜菜堿；3.亞砷酸（三價(jià)砷）

       4.二甲基砷；5.一甲基砷；6.砷酸（五價(jià)砷）

       對照品貯備溶液的制備 分別取亞砷酸、砷酸、一甲基砷、二甲基砷、砷膽堿、砷甜菜堿對照品適量，精密稱(chēng)定，加水制成每 1ml各含 2.0μg（均以砷計）的對照品溶液，即得。

       標準曲線(xiàn)溶液的制備 精密吸取對照品貯備溶液適量，加0.02mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液制成每1ml各含1ng、5ng、20ng、50ng、100ng、200ng、500ng（均以砷計）系列濃度的溶液，搖勻，即得。

       供試品溶液的制備

       （1）礦物藥及其制劑：除另有規定外，取供試品適量，取相當于含砷量20～30mg的供試品粉末（過(guò)四號篩），精密稱(chēng)定，精密加入人工腸液適量，置37℃水浴中超聲處理適當時(shí)間，搖勻，取適量，靜置約2420～36小時(shí)，吸取中層溶液適量，用微孔濾膜（10μm）濾過(guò)，精密量取續濾液適量，用0.02mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液稀釋至一定體積，搖勻，即得。同法制備空白溶液。

       （2）動(dòng)、植物類(lèi)中藥（除甲類(lèi)、毛發(fā)類(lèi)）：除另有規定外，取供試品粉末（過(guò)三號篩）0.2～0.5g，精密稱(chēng)定，精密加入硝酸人工胃液適量，置37～45℃水浴中加熱約20～24小時(shí)，取出，搖勻，放置2小時(shí)，取上清液，用一次性雙層濾膜（10μm+3μm）濾過(guò)，取續濾液，即得。同法制備空白溶液。

       測定法 分別吸取系列標準曲線(xiàn)溶液和供試品溶液各20～100μl，注入液相色譜儀，測定。以系列標準曲線(xiàn)溶液中不同形態(tài)砷或不同價(jià)態(tài)砷的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線(xiàn)，計算供試品溶液中不同形態(tài)或不同價(jià)態(tài)砷的含量，即得。

       【附注】

       ①　所用玻璃儀器使用前均需以20%硝酸溶液（V/V）浸泡24小時(shí)或其他適宜方法進(jìn)行處理，避免干擾。

       ②　本法系汞和砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)的通用性測定方法，在滿(mǎn)足系統適用性的條件下，并非每次測定均需配制3種汞或6種砷的形態(tài)及其價(jià)態(tài)系列標準曲線(xiàn)溶液，可根據實(shí)際情況僅配制需要分析的汞或砷形態(tài)及其價(jià)態(tài)的系列標準曲線(xiàn)溶液。

       ③　進(jìn)行汞元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)分析時(shí)，由于色譜柱中暴露的未完全封端硅羥基對Hg²⁺的影響，導致色譜柱柱效損失較快。建議采用封端覆蓋率較高的色譜柱，且必要時(shí)，在一定進(jìn)樣間隔，以采用閥切換技術(shù)以高比例有機相沖洗色譜柱后再繼續分析。

       ④　硝酸人工胃液：取32.8ml稀硝酸，加水約800ml與人工胃蛋白酶10g，搖勻后，加水稀釋成1000ml，即得。

       ⑤　因中藥成分復雜且砷、汞含量差異較大，故本法中稱(chēng)樣量?jì)H供參考。礦物藥及其制劑的取樣量一般應折算至含砷量或含汞量20～30mg；動(dòng)、植物類(lèi)中藥（除甲類(lèi)、毛發(fā)類(lèi)）的取樣量應根據樣品中砷或汞的含量來(lái)確定適宜的量，一般為0.2～0.5g。

       ⑥　本法中規定的供試品溶液制備方法系通用性的推薦方法，實(shí)踐中可根據樣品基質(zhì)的不同而進(jìn)行參數的適當調整，并在各品種項下另作詳細規定，同時(shí)進(jìn)行必要的方法驗證。

       ⑦　供試品中汞或、砷形態(tài)或價(jià)態(tài)的限量應符合各品種項下的規定。

       三、2020版《中國藥典》執行后展望

       根據監管需要，對標國際先進(jìn)標準，國家藥典委員會(huì )官網(wǎng)發(fā)布了2322《汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定法》（第三次征求意見(jiàn)稿），將專(zhuān)屬性強、鑒別力好、成熟度高的檢驗方法納入標準，合理升級了汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定標準，該標準的升級為推動(dòng)中藥材國際標準化發(fā)展將起到較好的引領(lǐng)作用，對提升板中藥材產(chǎn)品的國際影響力和競爭力，推動(dòng)中藥材產(chǎn)品國際貿易發(fā)揮重要作用，國家藥監部門(mén)明確表示，良藥走遍天下，劣藥寸步難行，再次給中藥行業(yè)質(zhì)量監管敲響了警鐘，2020版《中國藥典》的制修訂更接地氣，緊密聯(lián)系監管實(shí)際，及時(shí)滿(mǎn)足監管需求，充分體現藥典標準的主要功能作用，即鼓勵好藥，淘汰劣藥，鑒別真偽，評判優(yōu)良，更好地為監管服務(wù)，有關(guān)企業(yè)需提前領(lǐng)會(huì )汞、砷元素形態(tài)及其價(jià)態(tài)測定標準的創(chuàng )新和變化，做到清楚各項標準內涵，理解標準內容，掌握標準操作，便于今后正確按照升級后標準進(jìn)行檢驗。

       參考文獻

       [1] www.chp.org.cn/view/ff8080816e444b7f016f180a38d536b0?a=BZFL

       作者簡(jiǎn)介：滴水司南，男，生物醫藥高級工程師，立足于生物醫藥行業(yè)質(zhì)量管理工作，專(zhuān)注于生物醫藥產(chǎn)業(yè)，希望在知識的海洋里，用簡(jiǎn)單的語(yǔ)言講述不簡(jiǎn)單的專(zhuān)業(yè)知識，提供一枚知識的指南針，指引讀者到達知識的彼岸。